1.1. Introducción

En las páginas que vienen a continuación veremos varios aspectos de los métodos de investigación en humanos en genética del comportamiento. Por un lado, introduciremos el estudio de la variabilidad de un rasgo o característica en una población cómo fuente de información genética. A continuación vamos a presentar un modelo clásico en genética del comportamiento y que aún se utiliza con frecuencia, aunque con algunas variantes, el modelo biométrico, y una derivación de este, el modelo psicométrico. Una vez presentados los conceptos clave en el punto anterior, veremos cómo se relacionan genes y ambiente entre ellos y que implicaciones tienen las diferentes formas de relación en el desarrollo ontogenético del comportamiento.

Así, haremos un breve repaso de los estudios de gemelos, los estudios de adopciones y familias, el análisis de extremos, la cartografía de loci de rasgos cuantitativos (QTL en lengua inglesa) y los estudios de asociación.

1.2. Contenidos

Todas las personas somos diferentes, pero todas tenemos cosas en común. Esta afirmación que puede parecer tan sencilla ha originado décadas de investigación en psicología diferencial. Tradicionalmente, las neurociencias se han ocupado de investigar “universales”, es decir, aquello que sea aplicable a toda una especie, o a toda una clase. Sin embargo, se han ocupado poco de la variación intraespecífica. Esto plantea problemas en muchas áreas de la psicología. Por ejemplo, ¿porqué unos niños tienen dificultades para aprender a leer y otros no? ¿O Porqué hay personas que padecen depresión, y otras que han sufrido las mismas adversidades no la padecen? La respuesta a estas preguntas reside en el estudio de las diferencias individuales.

Precisamente, comprender las diferencias individuales y el origen de éstas nos puede ayudar a intervenir sobre ellas o explicarlas. Mediante el estudio de la variabilidad, o varianza con datos genéticos podemos descomponer las fuentes de variación (Plomin, DeFries, Craig, & McGuffin, 2002). Así, aunque el debate entre naturaleza y ambiente parece ser interminable (Bouchard & McGue, 2002), los investigadores en genética del comportamiento están llegando a un acuerdo más o menos consensual acerca de la influencia de la naturaleza, del ambiente y especialmente de la naturaleza vía ambiente (nature via nurture).

A lo largo del capítulo iremos viendo diferentes aproximaciones metodológicas a la genética del comportamiento, desde un enfoque más molar, más generalista, que estudia tanto las influencias ambientales cómo las genéticas, a estudios centrados en la localización de regiones en el genoma relacionadas con un rasgo (estudios de ligamiento y QTLs), para después poner a prueba la asociación de genes candidatos de esas regiones en los estudios de asociación. Por otra parte, aunque no es el objeto de este texto, la investigación en genética del comportamiento también debe echar mano del descubrimiento de factores de riesgo ambientales, puesto que pueden afectar diferencialmente la expresión de algunos genes (interacciones GxE).

1.2.1. El modelo biométrico de descomposición de la varianza

1.2.1.1. Introducción y concepto de heretabilidad y ambientalidad

Sir Francis Galton, en su libro Hereditary genius: an inquiry into its laws and consequences (El genio hereditario: una investigación de sus leyes y consecuencias, 1892) fue el primero que investigó científicamente las causas genéticas y ambientales de las diferencias individuales en humanos. Su proposición básica era que si un rasgo está determinado genéticamente, cuanto más cercanos sean dos parientes, más similares deberán ser para ese rasgo. Años después, Ronald Fisher ofreció la primera explicación matemática de cómo las correlaciones entre familiares podían ser explicadas en base a la herencia mendeliana (Neale & Maes, en prensa). Su contribución principal fue el desarrollo del concepto de la verosimilitud, imprescindible para los avances que vendrían después y aún hoy utilizada.

La determinación de la importancia relativa de los genes y el ambiente se consigue mediante el ajuste de diferentes modelos estadísticos que veremos más adelante, pero para entenderlos, antes debemos presentar dos conceptos que son clave, la heredabilidad y la ambientalidad.

La heredabilidad (heredabilidad en sentido amplio o heredabilidad amplia), también representada cómo H ², es un estadístico descriptivo que podemos definir cómo la proporción de varianza fenotípica de una población que es debida a la variación genética de ésta.

(1)

Esta varianza genética puede descomponerse en varianza (1) genética aditiva (A), en la cual valores genotípicos provocan efectos lineales en el fenotipo; varianza genética no-aditiva (D), que representa influencias genéticas cómo la dominancia (interacciones entre alelos en un mismo locus) y la varianza genética epistática (I) o interacciones entre loci, también conocidas cómo epistasis. En definitiva, la heredabilidad amplia puede representarse cómo:

(2)

Además de la heredabilidad en sentido amplio, también podemos hablar de la heredabilidad en sentido estricto (h ² , en minúsculas). En este sentido, la heredabilidad en sentido estricto es la proporción de la varianza del fenotipo que es transmisible de los padres a la descendencia y que puede ser utilizada para predecir los cambios en la media poblacional con las técnicas de selección. Esta varianza es la única debida solamente a factores genéticos aditivos.

(3)

Por tanto,

(4)

A diferencia de la heredabilidad en sentido amplio, que no tiene ningún tipo de aplicación práctica, sinó meramente descriptiva, la heredabilidad en sentido estricto o reducido sí que la tiene. Así, ésta nos permite calcular la proporción de varianza de un rasgo a característica que se transmite de una generación a otra. Hemos de destacar que sólo es aplicable a poblaciones, no a individuos. Para ver cómo cambia la heredabilidad modificando los parámetros que la componense puede visitar un simulador de heredabilidad para llevarlo a cabo (http://www.evotutor.org/Selection/Sl4A.html).

Tabla 1. Definición, terminología y ejemplos para indicar las influencias debidas al ambiente compartido y no compartido.

Por otro lado, las diferencias ambientales entre individuos también pueden llevar a diferencias fenotípicas entre ellos. Así, la genética del comportamiento ha ofrecido la mejor evidencia para medir la importancia de los factores ambientales durante el desarrollo. Cómo en el caso de la varianza genotípica, la varianza ambiental también puede descomponerse en dos tipos (ver ecuación 5): varianza ambiental compartida (C), que contribuye a la similitud entre los miembros de una familia, y varianza ambiental específica (E) o no compartida, que se define cómo las influencias ambientales que hacen que un individuo se diferencie del resto de individuos de esa familia, además también incluye el error de medida:

(5)

Más concretamente, ¿qué es lo que entendemos por varianza ambiental compartida y varianza ambiental no compartida? Básicamente se corresponde al ambiente compartido y al no compartido. Vamos a ver en detalle a qué se refiere cada concepto.

1.2.1.1.1. Ambiente compartido

Son los factores ambientales que hacen que los miembros de una misma familia comparten y los hacen similares entre si: dos hermanos comparten en nivel cultural, socioeconómico familiar, dieta, etc. Si por ejemplo, el tipo de educación tiene una influencia en la personalidad y su desarrollo, se puede esperar que dos hermanos que hayan recibido el mismo tipo de educación sean más similares en ciertos aspectos de su vida que dos individuos seleccionados al azar (Martí i Carbonell y Darbra i Marges, 2006).

1.2.1.1.2. Ambiente no compartido

Según Martí i Carbonell y Darbra i Marges (2006), son los factores ambientales que los miembros de una familia no comparten entre si y que tienden a diferenciarlos entre ellos. Dos hermanos tienen, cada uno de ellos, sus propios amigos (que no tienen porqué compartir), pueden ir a colegio en clases diferentes, etc. Los miembros de una familia no comparten todo el ambiente; por ejemplo, el orden de los hermanos parece que influye algunos aspectos: no es lo mismo ser el primer hijo (y por tanto, recibir más atención por parte de los padres) que ser el cuarto o quinto hermano (interacción con los otros hermanos). A veces se puede confundir el ambiente no compartido con el ambiente no familiar, pero podemos ver que el ambiente no compartido se puede dar dentro del entorno familiar inmediato. Este tipo de influencias se ha visto que es muy importante en psicopatología, respecto a las habilidades cognitivas y respecto a la personalidad. Por el contrario, y curiosamente, este tipo de ambiente hace más semejantes a los gemelos monocigóticos que han vivido separados: a más edad, más semejantes, ya que seleccionan sus propios ambientes según su genotipo (lo veremos en el siguiente apartado), y esto los hace similares, ya que es idéntico.

1.2.1.2. ¿Cómo se relacionan ambiente y genotipo?

Genotipo y ambiente, y sus correspondientes estimadores, no son entidades estancas y sin ningún tipo de relación entre ellas, más bien al contrario, acostumbran a interrelacionarse, y normalmente de forma imbricada, lo que dificulta la tarea de investigar estas relaciones. En general, ambiente y genotipo pueden correlacionar, o bien interactuar, ahora veremos de qué se trata en cada caso.

1.2.1.2.1. Correlaciones genotipo-ambiente

La correlación entre genes y ambiente se refiere a que un individuo con un determinado genotipo tiende a desarrollarse en aquellos ambientes que sean propensos a favorecer la expresión de este genotipo. Tradicionalmente se ha propuesto una taxonomia con tres tipos de correlaciones diferentes (Martí i Carbonell y Darbra i Marges, 2006):

a) Correlación pasiva: Se refiere al hecho que el ambiente dónde se desarrolla un individuo favorece la expresión de su genotipo. Se denomina pasiva porqué ni el comportamiento ni el genotipo del individuo determinan el ambiente dónde éste se encuentra. Se da en casos en los que por ejemplo, los padres aportan ambientes de crianza que correlacionan con los genes que han transmitido a los hijos.

b) Correlación activa: Se refiere a aquélla que se establece cuando es la propensión genética del individuo la que provoca que éste busque, y eventualmente seleccione el ambiente o experiencias que más favorezcan la expresión de esta propensión genética.

c) Correlación evocativa (o reactiva): Se refiere a aquella por la cual se establece una relación “evocada” entre los factores genéticos y los ambientales, en la cual es la propia expresión del genotipo la que provoca situaciones (reacciones) que favorecen la aparición de factores ambientales propicios al desarrollo de aquellas.

En algunos casos, esta correlación puede cuantificarse, formulándose cómo rGA (aunque en inglés el se conoce cómo rGE, por “Genotype-Environment”), o más concretamente cómo:

(6)

1.2.1.2.2. Interacciones genotipo-ambiente

En general, la interacción genotipo-ambiente hace referencia a la forma en que los genes y ambiente afectan al fenotipo conjuntamente, pudiéndose definir cómo el control genético de la sensibilidad a las diferencias ambientales. De esta forma, un mismo gen puede manifestarse de formas diferentes bajo la influencia de ambientes distintos, o bien alelos diferentes de un gen moderar la influencia de un mismo ambiente. Más adelante veremos algunos ejemplos concretos.

(7)

A pesar de ser conceptos similares, el concepto de correlación se debe diferenciar claramente del de interacción. El concepto de interacción hace referencia a como el ambiente puede regular diferencialmente la expresión de los genes, mientras que el concepto de correlación indica que el ambiente al que está expuesto un individuo tiende a estar asociado en cierta medida a su genotipo. Es decir, no hay una distribución aleatoria de exposición a determinados ambientes, sinó que algunos genotipos tienden a expresarse en determinados ambientes. Este tipo de interacciones es muy importante en las psicopatologías y también en las características de personalidad (Gallardo-Pujol, García-Forero y Andrés-Pueyo, en prensa; Martí i Carbonell y Darbra i Marges, 2006).

Resumiendo, las relaciones entre genes y ambiente son muy complejas, y por un lado tenemos que el ambiente puede modular la expresión de los genes, que los genes pueden modular el impacto del ambiente durante el desarrollo, y que a la vez, los genes pueden llegar a determinar el ambiente en el cual se expresan, así pues, la relación entre genes y ambiente es bidireccional.

1.2.1.3. Uniendo las piezas del rompecabezas: La descomposición de la varianza fenotípica o total

Finalmente, para completar lo explicado hasta ahora, debemos unir todas las piezas aisladas que hemos visto hasta ahora: los genes (o varianza genotípica), el ambiente (o varianza ambiental) y la interacción entre ambos. Habitualmente se expresa según la siguiente ecuación:

Figura 5. Ejemplo de distribución normal de un fenotipo. En el gráfico podemos ver que porcentaje de individuos presenta fenotipos alejados como mucho una desviación típica, dos o tres.

(8)

A partir de esta ecuación pueden calcularse parámetros cómo la heredabilidad o la ambientalidad, según diferentes modelos, cómo veremos más adelante cuando hablemos de los tipos de modelos en los estudios de gemelos.

Usualmente, para la mayoría de rasgos psicológicos, la distribución fenotípica de éstos acostumbra a ser normal. Es decir, la mayoría de la población muestra fenotipos parecidos a la media, mientras que a medida que nos alejamos de la media, disminuye la frecuencia de individuos con otros fenotipos. En los estudios en los que descomponemos la varianza total, lo que hacemos es estudiar que parte de la desviación del conjunto de los fenotipos se explica por los factores que hemos comentado hasta ahora.

1.3. Diseños y métodos de investigación

1.3.1. Estudios de gemelos

Cómo es bien sabido, la manipulación genética en humanos tiene limitaciones éticas, e incluso la investigación en genética del comportamiento es cuestionada por algunos. Por ello, dicha investigación tiene una serie de limitaciones prácticas inherentes que no tienen otras ramas del conocimiento científico. Sin embargo, la naturaleza nos ha brindado lo que algunos consideran un fantástico experimento natural, se trata los gemelos dizigóticos (DZ) y monozigóticos (MZ).

Las parejas de gemelos DZ y MZ (cuando son del mismo sexo), se diferencian básicamente porque los primeros comparten el 50% de sus genes en promedio, mientras que los segundos comparten el 100% de estos, y ambos comparten el 100% del ambiente compartido), así como nada del ambiente específico o no-compartido.

Cabe destacar que gracias a este tipo de estudios, podemos separar la variable ambiente en los componentes compartidos e independientes (por ejemplo, las diferencias entre parejas de gemelos monocigóticos que han vivido juntas son debidas al ambiente no compartido. También posibilitan los estudios de control, por ejemplo, hacer una intervención en el gemelo A y en el otro no, para probar la eficacia de un tratamiento (Martí i Carbonell y Darbra i Marges, 2006). Permiten examinar las condiciones de manifestación de una psicopatología (analizando los factores ambientales de riesgo). Pero no todo son ventajas, por ejemplo, el ambiente prenatal y post-natal de los gemelos MZ puede que sea más parecido que el de los DZ (esto lo veremos más adelante).

Pasemos a ver cómo se puede estudiar la influencia genética y ambiental en un rasgo mediante estudios de gemelos.

1.3.1.1. El modelo ACE

Este modelo, conocido por las iniciales de sus componentes en inglés (Additive gene-tic variance, Common environment variance y Error+specific Environment), ha sido ampliamente utilizado en la genética del comportamiento desde los años 70, y aún es vigente con algunas modificaciones. Mediante el uso de modelos de ecuaciones estructurales permite descomponer la varianza de forma eficaz y relativamente sencilla (Gallardo-Pujol, Kramp, García-Forero, Maydeu-Olivares y Andrés-Pueyo, 2007).

Este modelo asume que toda la varianza genética es aditiva y que no hay interacción entre factores genéticos y ambientales, por eso, de la ecuación que veíamos más arriba, podemos derivar la que sigue:

(9)

Pese a esta simplificación, permite determinar la contribución relativa del ambiente y de los genes en un determinado rasgo. Aunque hay otras fórmulas más sencillas para calcular la heredabilidad en sentido estricto de un rasgo comparando gemelos MZ y DZ^{1 (1)} , estas tienden a estimarla de forma incorrecta, además, el uso de modelos de ecuaciones estructurales presenta ventajas añadidas. Es posible contrastar hipótesis de forma estadística y comparar si realmente cada una de las fuentes de varianza (A, C o E) son significativas para este modelo o no. Es decir, permite determinar si A, C o E realmente determinan parte de la varianza fenotípica del rasgo en cuestión o no. En la figura podemos ver su forma más sencilla.

Figura 6. Diagrama de sendero (Path diagram) que representa el modelo ACE. Las variables latentes (redondas) representan la varianza genética aditiva (A), el ambiente compartido (C) y el ambiente específico (E) para cada pareja de gemelos. Los cuadrados representan la variable que estamos midiendo en cada miembro de la pareja de gemelos (R1 y R2). Las flechas con dos puntas representan correlaciones y las flechas con una sola punta representan rutas causales.

Por otro lado, en algunas ocasiones en Psicología, las variables no son observables, sino que son variables latentes, cómo por ejemplo los rasgos de personalidad o g, una medida de inteligencia. Llegado este momento, las cosas se complican y hay que añadir estas variables al modelo, conociéndose entonces como modelo psicométrico.

Sin embargo, estos modelos, así como los estudios de gemelos cuentan con una serie de limitaciones. Entre ellas, la excesiva simplificación las relaciones entre genotipo y ambiente por un lado, así cómo las críticas al sesgo de las muestras de gemelos o el no tener en cuenta los ambientes prenatales son las más destacables. Por contra, la versatilidad de estos modelos para tener en cuenta el apareamiento selectivo, la transmisión “cultural” de algunas características o la utilización de grandes muestras (cómo por ejemplo el Twin Early Development Study, una muestra de más de 15.000 parejas de gemelos en el Reino Unido (Trouton, Spinath, & Plomin, 2002)) representativas de la población general hacen que estas limitaciones empiecen a superarse. Así, aunque algunos critican la poca utilidad que pueden tener hoy en día estos modelos, se muestran útiles cuando se trata de estudiar la contribución relativa del genotipo o el ambiente en cuestiones cómo por ejemplo las dificultades de lectoescritura o el acoso escolar o bullying.

A pesar de todo, los estudios de gemelos no están exentos de problemas. Algunos de los más relevantes son la asunción de los ambientes iguales, y el otro es el fenómeno del emparejamiento selectivo. La asunción de los ambientes iguales asume que tanto los gemelos monocigóticos cómo los dicigóticos comparten ambientes comparables con respecto a la característica de interés. Esto es, los gemelos monocigóticos no son más similares entre ellos para un determinado rasgo simplemente porque sean tratados de forma más similar. Si bien es cierto que hay algunas diferencias básicas entre el ambiente al que estan expuestos los gemelos monocigóticos y los dicigóticos, la mayor parte de las investigaciones que se han ocupado del tema ha respaldado esta asunción (DiLalla, 2004). El segundo problema relevante es el del emparejamiento selectivo. Es bien conocido que hay una tendencia a buscar pareja con unas características de personalidad e inteligencia parecidas a las nuestras (Colom, Aluja-Fabregat, & García-López, 2002), si esto sucede en el caso de los padres de gemelos dicigóticos, compartirían más genes relacionados con la personalidad o la inteligencia que los esperables por azar. Esto reduciría la diferencia con los gemelos monocigóticos, arrojando una estimación de heredabilidad más baja de lo que en realidad es. Sin embargo, mediante la utilización de modelos de ecuaciones estructurales, esta circunstancia puede modelarse fácilmente.

1.3.2. Estudios de de familias

En este tipo de estudios se compara un rasgo entre sujetos relacionados biológicamente. Si el rasgo es cualitativo, será más frecuente cuanto más estrecha sea la relación entre los parientes (grado de parentesco). Si el rasgo es cuantitativo, la semejanza (medida con un coeficiente de correlación) será mayor cuanto más estrecha sea la relación biológica. Es preferible que los familiares hayan sido criados de forma separada, ya que sino hay el inconveniente de que compartan herencia y ambiente.

Los estudios familiares son útiles para (Martí i Carbonell y Darbra i Marges, 2006):

• Entender la heterogeneidad de un diagnóstico: en una familia puede haber afectados de esquizofrenia, pero también, cómo veremos más adelante cuando hablemos de psicopatologías, afectados de depresión unipolar o trastorno bipolar, lo que quiere decir que es posible que haya una relación genética entre estas enfermedades.

• Hacer estudios de alto riesgo: estudios longitudinales de los descendientes jóvenes de los afectados. Este tipo de estudios permiten obtener información de los factores de riesgo y protección, y conocer los síntomas tempranos a partir de los hijos de los afectados. Permiten identificar individuos vulnerables y hacer prevención.

• Comprender la expresividad variable del gen o genes, ya que cómo son de la misma familia, el gen es el mismo.

• Conocer el tipo de herencia, mediante pedigríes.

Sin embargo, también tienen desventajas, ya que los familiares:

• Comparten tanto herencia cómo ambiente,

• Tienen edades diferentes, y

• Pertenecen a generaciones diferentes (padres e hijos).

1.3.3. Estudios de adopciones

En los estudios de adopciones, las variables genéticas y ambientales pueden ser separadas por el proceso de adopción, siempre y cuando el ambiente de destino no sea similar al ambiente de origen. La principal ventaja es que permiten el análisis de la interacción entre genes y ambiente, al comparar hijos que viven con sus padres biológicos y otros que no. Hay varios diseños posibles en el caso de los estudios de adopciones, vamos a verlos (Martí i Carbonell y Darbra i Marges, 2006):

Figura 7.

b) Método de las familias de los adoptados: se comparan los familiares (tanto biológicos cómo adoptivos) de los adoptados con los familiares de los adoptados no afectados.

Figura 8.

c) Método de la crianza cruzada o cross-fostering: Se comparan tres grupos entre si. El primero consta de hijos con padres biológicos afectados y padres adoptivos no afectados. El segundo consta de hijos con padres biológicos no afectados y padres adoptivos afectados. El tercer grupo es un grupo control (hijos de padres biológicos y adoptivos no afectados).

Sin embargo, estos estudios son menos frecuentes que los de gemelos, ya que es más dificultoso encontrar una muestra de adoptados que reúna las condiciones necesarias de potencia estadística que una muestra de gemelos (DiLalla, 2004).

1.3.4. Análisis de extremos

En algunos casos, nos podemos encontrar que la característica que pretendemos estudiar no es cualitativamente diferente de una característica distribuida de forma normal en una población, sino cuantitativamente. Por ejemplo, podríamos hipotetizar que la dislexia sea un extremo de la distribución de las habilidades lectoras en la población general.

En este caso, el análisis de extremos (o análisis DF, en honor a sus creadores, DeFries-Fulker) utiliza los valores de los casos de los extremos y los de sus familiares. Brevemente, las puntuaciones medias de lectura de los hermanos no afectados de cada pareja de gemelos MZ estarán más alejadas de la media de la población que las puntuaciones medias de los hermanos no afectados de dislexia de cada pareja de gemelos DZ. El análisis de los datos se efectúa mediante modelos de regresión, que pueden ser multivariantes, incorporar covariables y son relativamente flexibles. Fue una técnica bastante utilizada al no ser computacionalmente tan exigente como los modelos de ecuaciones estructurales que hemos explicado un poco más arriba. Ahora sin embargo, se han visto superados por estos últimos.

Esta aproximación, sin embargo, sentó las bases para lo que se conoce cómo análisis de las diferencias entre hermanos (sib pairs analysis) cómo forma para incrementar la potencia estadística al detectar efectos de los genes en muestras no excesivamente grandes. Más adelante veremos cómo funciona.

1.3.5. Cartografía de QTL y estudios de ligamiento

A diferencia de los diseños comentados hasta ahora, que forman parte de la genética cuantitativa, los estudios de asociación y ligamiento forman parte de las técnicas de estudio de la genética molecular, ya que se comparan fragmentos concretos de ADN. Ambos tipos de estudios son complementarios y generalmente ambos son necesarios antes poder relacionar definitivamente un marcador genético con un rasgo conductual o una enfermedad.

En muchos casos, aunque encontremos que un gen está asociado a un determinado rasgo, puede pasar que, o bien después no consigamos replicar el efecto encontrado, o este efecto sea muy pequeño. Ello es debido a que características tan complejas cómo el comportamiento están influenciadas por múltiples genes de efectos muy pequeños. Estos genes, cada uno con un efecto relativo pequeño, se denominan QTL (del inglés Quantitative Trait Loci, o sitios de rasgo cuantitativo).

En la cartografía de QTL, se pueden analizar partes del genoma o el genoma entero. Es una técnica basada en las técnicas de ligamiento que consiste en explorar mediante la utilización de marcadores situados de forma más o menos equidistante (aproximadamente 10 cM), la asociación de estos marcadores con el fenotipo. El objetivo es encontrar un marcador que significativamente sea más probable que esté asociado a un rasgo que por azar. Normalmente, cuando se detecta un QTL asociado a un rasgo, no se detecta el gen propiamente dicho, pero si que es posible que en esa región se encuentre el gen que provoca el efecto que observamos.

Pero, ¿Cómo medimos si una posición está asociada a otro marcador? Pues con lo que se llama “Lod score”. El Lod score es el logaritmo en base diez del odds ratio o verosimilitud dependiendo de la frecuencia de recombinación de dos loci cercanos. Cuanto más elevada es esta cantidad, mayor es la probabilidad de que exista ligamiento y que esa región esté asociada al fenotipo que obervamos. Vamos a ver un ejemplo a continuación.

En esta figura podemos ver los 22 autosomas y algunos loci con unas puntuaciones LOD más elevadas. Concretamente, se tratan de dos regiones, una situada en el cromosoma 3, y otra situada en el cromosoma 10, que son susceptibles de presentar ligamiento. Este estudio corresponde a un estudio que explora el consumo de cannabis durante la adolescencia (Hopfer et al., 2007). Respecto a los criterios para interpretar una puntuación LOD, se puede encontrar más información en Lander y Kruglyak (1995).

1.3.6. Estudios de asociación

Los estudios de asociación comparan diferentes poblaciones y estudian si una determinada mutación o variante del marcador (por ejemplo, un alelo de un gen) se ve incrementada o disminuida significativamente en la población sujeta a estudio. Esta comparación permite el cálculo de unos valores estadísticos llamados razón de ventajas (odds ratio en inglés), que nos indican cual es el riesgo de presentar un rasgo cualitativo o una enfermedad en los portadores en comparación con los no portadores de esta variante. En los capítulos de personalidad y psicopatología veremos bastantes ejemplos de estudios de asociación.

1.4. Errores a evitar en la interpretación de estudios en genética del comportamiento

En torno a la Genética del Comportamiento y el estudio de la herencia de los rasgos psicológicos, se han creado una serie de equívocos y de concepciones erróneas que conviene destacar (Andrés-Pueyo, 1997):

Error 1: Los efectos genéticos sobre los rasgos psicológicos son del tipo todo o nada.

De hecho, los efectos genéticos en el comportamiento se conocen en términos cuantitativos y los estudios empíricos, cómo hemos visto, se fundamentan en conocer “cuánto” es el valor del efecto de los genes sobre la conducta.

Error 2: La vía de acción de un gen sobre una conducta o rasgo es simple, específica y directa.

Nada más lejos de la realidad, cómo veremos más adelante, sobre las relaciones entre fenómenos, el genético y el psicológico, que actúan en planos de explicación muy distintos y alejados.

Error 3: Si un rasgo tiene un componente genético es inmutable.

Esta idea errónea parece no tener en cuenta el componente de cambio del individuo humano y la forma diferencial de actuar de los genes en función del momento del desarrollo individual.

Error 4: Las conductas o rasgos que están influenciadas por mecanismos genéticos aparecen precozmente en el desarrollo del individuo.

Habitualmente, se considera que todo el repertorio de aspectos del comportamiento que tienen una cierta influencia genética deben aparecer en el momento del nacimiento y que, a lo largo del desarrollo, solamente los efectos del ambiente quedarán patentes. El conocimiento de los mecanismos de acción genética ha demostrado la falsedad de este tipo de argumentos ya que los genes actúan no únicamente en el momento de la concepción, sino que lo hacen durante toda la vida del individuo.

Estas ideas, muy difundidas, son erróneas y actualmente hay indicios aplastantes para rebatir cualquiera de éstas. A lo largo de los siguientes capítulos ofreceremos algunos estudios que ejemplificarán alguna de estas concepciones erróneas.

2.1. Conceptos generales

Existen múltiples sistemas para realizar la extracción y purificación de ADN genómico a partir de distintos tejidos humanos. Aquí nos centraremos en la metodología de análisis una vez se ha obtenido este ADN a partir de alguno de estos métodos.

2.1.1. Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain reaction: PCR)

La amplificación enzimática del ADN consiste en la obtención de copias de una secuencia específica de ADN mediante una reacción en cadena de la ADN polimerasa (PCR). La aplicación de esta metodología en los laboratorios de genética es hoy en día imprescindible.

Las ADN polimerasas son enzimas que llevan a cabo la replicación del ADN. Se obtienen a partir de microorganismos termófilos adaptados a vivir en afloramientos termales, como Termophilus aquaticus. Para ello precisan de una molécula de ADN de cadena sencilla que actúe como molde, un cebador (una moléculaa de ADN de unos 15 a 20 nucleótidos que híbrida con el ADN genómico, al tener una secuencia complementaria de esta) y los cuatro tipos de nucleótidos activados o trideoxinucleótidos, para ser incorporados en la cadena naciente de forma específica. Estos trideoxinucleotidos o dNTPs serán los “ladrillos” a partir de los cuales se irán sintetizando las nuevas cadenas de ADN. Recordemos que químicamente son pentosas unidas a un grupo energético de tres fosfatos en el carbono 5’, a cuatro posibles purinas o pirimidinas diferentes en el carbono 1’y a un grupo hidroxilo en el carbono 3’. Estas serán las adeninas (A), guanosinas (G), citosinas C) y timinas (T).

Recordemos también que las dos hebras de ADN (o los dos cebadores con el ADN) se acoplan normalmente de forma antiparalela mediante enlaces de puentes de hidrógeno entre bases complementarias (A con T y G con C).

Mediante la aplicación de calor y concentraciones salinas adecuadas las dos hebras pueden separarse, se dice entonces que el ADN esta desnaturalizado. Si se restablecen las condiciones iniciales, las hebras de ADN volverán a unirse específicamente por las zonas complementarias, es decir, hibridándose. Ahora resumiremos en que consiste la reacción de PCR: la mezcla de dNTPs, ADN, oligonucleótidos y polimerasa es sometida a ciclos repetidos de diferentes temperaturas para favorecer la separación de las dos hebras del fragmento de ADN de interés, la hibridación de los oligonucleótidos y su posterior síntesis de cadenas nuevas. A la temperatura de 94°C se separan las cadenas de ADN, y después, para favorecer el apareamiento del oligonucleótido con su secuencia complementaria de ADN, se reduce la temperatura hasta un valor específico para cada par de oligonucleótidos (50-65°C). La ADN polimerasa iniciará entonces la extensión de la cadena, normalmente a 72°C. Y a partir de aquí se va repitiendo este ciclo unas 30 o 40 veces.

Teóricamente la cinética que sigue la reacción es N x 2ⁿ, donde N es el número de moléculas iniciales del fragmento diana y n el numero de ciclos de PCR realizados, de forma que sigue un crecimiento exponencial y después de 30 o 40 ciclos habrán millones de copias más que las existentes originalmente (Mullis et al., 1992).

2.1.2. Separación electroforética de ácidos nucleicos

Una vez se ha realizado la extracción de ADN a partir de tejido, o una amplificación de varios fragmentos del mismo, este se puede fraccionar de forma sencilla mediante una electroforesis. La utilidad de hacer esto ya lo veremos más adelante. En este método se dispone el ADN en una matriz semisólida compuesta de un polímero previamente estabilizado (agarosa o acrilamida), el cual actúa como una red que dificulta el paso de las moléculas en función de su tamaño. Para inducir el desplazamiento a través de la matriz se aplica un campo eléctrico y las moléculas se desplazan hacia el polo positivo. La electroforesis se realiza en un tampón a pH básico (usualmente 1xTBE) de forma que las moléculas de ADN están cargadas negativamente. Dado que la relación de carga neta de cada molécula a ese pH es la misma sea cual sea su tamaño, el parámetro discriminatorio para su separación es el tamaño del fragmento. Es decir, las moléculas menores pasarán más fácilmente a través de la malla mientras que las grandes quedarán retenidas o irán mas lentamente.

Dependiendo del tamaño de cada una de las moléculas a separar, se pueden utilizar diferentes concentraciones de agarosa o acrilamida, lo cual condicionará el tamaño de los poros en la malla y por tanto la velocidad de los fragmentos que los atraviesan. Además, la concentración del polímero condicionará el rango de tamaños de ADN dentro de los cuales puede discriminar (ejemplo, una malla muy laxa o con los poros muy grandes no podrá discriminar entre fragmentos de ADN muy pequeños ya que estos pasarán sin ningún “esfuerzo” entre dichos poros). Los polimeros de acrilamida crean una malla mas uniforme que las de agarosa y son capaces de discriminar diferencias de tamaño más precisos (Sambrook et al., 2001).

La tabla siguiente ofrece una idea del rango de concentraciones del cada polímero, dependiendo del tamaño de fragmentos a separar.

Después, para visualizar las bandas en el gel (correspondientes a los diferentes fragmentos de ADN) es necesario teñir el gel en una solución de bromuro de etidio, el cual se une al ADN con gran afinidad, y se observa posteriormente mediante una lámpara de luz ultravioleta. La luz ultravioleta produce fluorescencia en el ADN unido al bromuro de etidio. También pueden ser utilizados otros métodos para teñir el ADN y poder observarlo dentro del gel, como la tinción con plata (Sambrook et al., 2001).

2.1.3. Mutaciones o polimorfismos

Cambios en la composición del ADN se denominan mutaciones o polimorfismos. Por conveniencia, cuando una mutación esta presente en menos del 1% de la población y no genera ningún fenotipo patológico se le suele denominar polimorfismo. Llamaremos fenotipo a la expresión del genotipo en un determinado ambiente. Los rasgos fenotípicos incluyen rasgos tanto físicos como conductuales.

Podemos distinguir varios tipos de cambios o mutaciones del ADN:

• Cambios sencillos de nucleótidos. Una base -o nucleótido- es substituida por otra distinta. En este caso existirán dos alelos dentro del mismo locus, uno mutado y otro normal (en genética de poblaciones, llamado alelo salvaje o wild). Por conveniencia utilizaremos las siglas en ingles SNP (single nucleotide polymorphism) para este tipo de polimorfismos.

• Pequeñas deleciones o inserciones. Un número reducido de nucleótidos se pierden o insertan, alterando la secuencia y tamaño de la molécula de ADN. Puede incluir desde una deleción/inserción de una sola base a uno o varios exones dentro de un gen. En estos casos existe la posibilidad de que se rompa el marco de lectura, esto es, que a partir de donde se produzca la inserción/deleción se cambie la interpretación en la traducción y se cambie completamente la secuencia de la proteína original, dando lugar probablemente a una proteína sin función metabólica.

• Cambios en el número de repeticiones de una secuencia de ADN. Entre ellas se encuentran las mutaciones microsatélites, que son repeticiones en tandem de secuencias de entre 2 y 4 pares de bases (pb), y minisatélites, que son repeticiones de pb de entre 6 y 100 pb. Algunas mutaciones microsatélites son inestables o dinámicas debido a que el número de repeticiones de estas variantes puede variar de una generación a otra. Este número de repeticiones puede estar directamente asociado con la patogenicidad (Ejemplo: Hungtintina en la enfermedad de Hungtinton).

• Grandes reorganizaciones. Ganancias, pérdidas o cambios en la orientación de grandes fragmentos de ADN. Estas reorganizaciones pueden incluir a un gen entero o un grupo de genes, y a veces es posible visualizarlas en el cromosoma en metafase mediante el microscopio.

El posible efecto funcional o no de este tipo de cambios en la proteína resultante puede venir dado por diversos factores: Que se produzca un cambio en la secuencia de la proteína o bien una proteína truncada, o bien que se altere la estabilidad del RNA mensajero (ARNm) o cambios en la expresión génica, que darían lugar a cambios en los niveles de proteína etc. Dicho de otra manera, la forma en que una mutación causa una determinada enfermedad, o alguna característica fenotípica puede venir dado por diferentes mecanismos.

Además, aún en el caso de que la mutación genética produzca un cambio en la secuencia de la proteína resultante, por ejemplo mediante un cambio de aminoácido por otro, no necesariamente provoca un cambio en la funcionalidad de la proteína, ya que esto dependerá de las características fisicoquímicas del aminoácido cambiado y de la región o dominio de la proteína donde se haya producido la mutación. Dicho de otra manera: un cambio genético no tiene porque causar alteraciones en el fenotipo. Por ejemplo, cuando encontramos una mutación en un gen candidato para alguna enfermedad hemos de asegurarnos que sea efectivamente patogénica. Para ello tenemos varias posibilidades. 1) Si se trata de un caso familiar hacer un estudio de cosegragación, es decir determinar si dentro de una familia la mutación aparece presente en los enfermos y no en los miembros sanos. 2) Genotipar cientos de individuos en la población general para determinar la posible presencia de esa mutación. Si no esta presente será más probable que se trate de una mutación patogénica y no de un polimorfismo inocuo. 3) Predicciones informáticas que computan la probabilidad de que un determinado SNP, dentro de una secuencia determinada, pueda causar alteraciones en alguna actividad biológica, o en el splicing alternativo, la expresión etc (Ejemplo en http://pupasuite.bioinfo.cipf.es) 4) Estudios funcionales (modelos animales, celulares etc) con los que podamos comprobar si la mutación causa una alteración funcional de la proteína mutada.

2.1.4. Concepto de Haplotipo, desequilibrio de ligamiento y tagSNP. Proyecto HapMap

Es importante comprender bien este concepto, ya que todos los polimorfismos y mutaciones están formando haplotipos, y su utilización es muy útil en la búsqueda de genes que influyen en un determinado fenotipo (Lee et al., 2005). Recordemos que para cada par de cromosomas recibimos una cromátida diferente de cada progenitor, con lo cual recibimos también una dotación de mutaciones y polimorfismos de uno y de otro. Es decir, hay una serie de mutaciones en la misma cadena de ADN que se transmiten todas juntas: esto es un haplotipo. Teóricamente pues, un haplotipo estaría constituido por cada uno de los cromosomas. No obstante, en cada generación se produce recombinación entre diferentes cromátidas, mezclándose las cadenas de ADN y, por consiguiente, también los diferentes polimorfismos de cada progenitor. Esta recombinación no es totalmente al azar, ya que hay zonas de “hot spots”,o lugares con mayor probabilidad de recombinación, con lo cual los polimorfismos entre dos áreas “hot spots” o de recombinación contiguas tenderán a seguir transmitiéndose en bloque y conservándose a lo largo de muchas generaciones. Aquí estarían ”encerrados” toda una serie de polimorfismos que estarían formando un bloque de muchos haplotipos. Así, cuando dos polimorfismos están dentro del mismo haplotipo no segregan independientemente en cada generación, sino siempre juntos, se dice entonces que ambos polimorfismos están en desequilibrio de ligamiento completo. Como hemos dicho, hay que tener en cuenta que la recombinación meiótica puede actuar en contra de la conservación de los haplotipos antiguos, por eso el desequilibrio de ligamiento completo entre dos polimorfismos puede ir desapareciendo con el tiempo, pasando por estadios de desequilibrio de ligamiento parcial. Veámoslo con un ejemplo. Imaginemos dos SNPs, ambos dentro del mismo par de cromosomas, el SNP1 con dos alelos A y T, y el SNP2 con los alelos G y C. Para un individuo dado hay tres genotipos posibles para cada SNP (en negrita) y nueve teóricas combinaciones de haplotipos. En la siguiente tabla lo veremos mejor. En el caso de que el SNP1 tenga el genotipo AA y el SNP2 el genotipo GC, no habrá indeterminación acerca de los haplotipos existentess: estarán presentes el haplotipo A-G y el haplotipo A-C. Observamos que en el caso de los heterocigotos dobles hay dos posibles combinaciones indeterminadas de haplotipos que podrían existir marcado con interrogante, o dicho de otra manera la fase es ambigua.

Se pueden resolver los haplotipos ambiguos, pero requieren sistemas trabajosos de clonaje y posterior secuenciación. Sin embargo, cuando se conocen los genotipos de un número elevado de individuos, es posible inferir estadísticamente los haplotipos en los casos ambiguos. Esto se hace utilizando métodos de combinatoria, o funciones de máxima verosimilitud combinados con algoritmos EM (Expectation-maximization) y pudiendo ajustar con covariables (Chen et al., 2008). Existen multitud de programas informaticos de libre uso para realizar estos cálculos por ejemplo UNPHASED (http://linkage.rockefeller.edu/soft/list4.html). Esto puede ser util para realizar estudios de asociación caso-control, para comparar estadisticamente si existen diferencias significativas entre las frecuencias haplotipicas de un grupo control y el grupo de casos patológicos, o bien relacionando un determinado haplotipo con algun rasgo cuantitativo de la conducta.

Todo esto nos lleva al concepto de tagSNP. Como existen muchos polimorfismos que se transmiten en un determinado bloque seria redundante genotiparlos todos, por el contrario si sabemos que existe un desequilibrio de ligamiento completo podemos genotipar solo uno de ellos, el cual nos estará dando información sobre toda la serie de polimorfismos asociados a ese tagSNP.

Como derivación del Proyecto Genoma Humano, se ha realizado una base de datos en la que se describen las diferentes estructuras haplotípicas en varias poblaciones humanas analizando cientos de miles de SNPs distribuidos a lo largo de todo el genoma. Se ha utilizado ADN de doscientos setenta individuos de cuatro poblaciones diferentes (con ancestros Europeos, africanos o asiáticos). Esto ha permitido determinar a grandes rasgos las frecuencias genotípicas de cada polimorfismo conocido en cada una de las poblaciones y su estructura haplotípica particular. El International HapMap Project (www.hapmap.org), ha creado así una base de datos accesible para su utilización por la comunidad científica. Con este medio es posible seleccionar el mínimo número de tagSNP en una población, que aporten la máxima información de una región genética en concreto. Para más detalles consultar el artículo Thorisson et al. A User’s guide to the International HapMap project web site (http://www. hapmap.org/downloads/presentations/users_guide_to_hapmap.pdf).

2.2. Hibridación de ácidos nucleicos

En los laboratorios de biología molecular se usan normalmente dos tipos de análisis tradicionales basados en hibridaciones de ácidos nucleicos (Southern y Northern blot). Ambos métodos se basan en la desnaturalización de los ácidos nucleicos y posterior unión con una sonda específica (otra cadena de ADN) de la secuencia de interés (Sambrook et al., 2001).

2.2.1. Southern blot

Es una técnica empleada para detectar secuencias específicas de ADN. El ADN genómico se digiere mediante enzimas de restricción (de secuencia de corte poco frecuente) en fragmentos menores, y estos son separados mediante una electroforesis en un gel. El ADN es desnaturalizado, transferido y fijado a un filtro de nitrocelulosa o nylon. Tradicionalmente este proceso se llevaba a cabo colocando el gel de agarosa sobre papel filtro remojado en una solución llamada de transferencia (solución salina concentrada). A continuación se sitúa la membrana sobre el gel y encima de esta una pila de papel filtro seca, y por capilaridad la solución de transferencia es arrastrada a la pila de papel filtro, quedando el ADN retenido en la membrana situada en medio. Existe una variación de esta técnica, en la que un aparato aspira el aire secando el gel y creando un vacío de forma que arrastre al ADN hacia el filtro de forma uniforme.

Lo verdaderamente importante, es que en este filtro quedarán representados los fragmentos de ADN como una réplica de la que tenían en el gel inicial. Entonces una sonda de ADN marcada con radiactividad o con un fluorocromo hibrida de forma específica con la secuencia de interés. Después se visualizan los resultados mediante la exposición a una película sensible a la radioactividad o a la luz, dependiendo de si se ha utilizado una sonda marcada con radioactividad o con un fluorocromo. Este sistema es útil para la detección de grandes reorganizaciones cromosómicas como translocaciones, inversiones etc.

2.2.2. Northern blot

Esta técnica es muy similar a la anterior, excepto que en este caso sirve para identificar secuencias de ARN. El ARN se fracciona en diferentes tamaños mediante una electroforesis en un gel, en unas condiciones en que se mantengan las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. El método del Northern se puede utilizar para realizar estudios de expresión génica en diferentes tejidos, de forma que puedan identificarse el patrón de splicing alternativo dentro de un gen.

2.3. Métodos de genotipado del ADN

2.3.1. Secuenciación de ADN

La secuenciación del ADN es la determinación del orden de los diferentes nucleótidos en un fragmento dado. Pongamos por caso que en Estados Unidos se encuentren unas mutaciones determinadas en un gen, las cuales provocan autismo. Podemos analizar esas mutaciones en concreto en nuestra población (para el diagnóstico por ejemplo), pero podría ocurrir que en nuestra población existieran unas mutaciones diferentes en el mismo gen que también fueran patogénicas. Para estar seguros de analizar de forma sistemática este gen, lo mejor es olvidarnos de buscar unas mutaciones en concreto y analizar el gen entero para detectar todas las posibles mutaciones. El método más informativo y fiable para conocer un determinado gen o secuencia es realizar la secuenciación directa del mismo. Tradicionalmente se ha utilizado el método de terminación de la cadena (o método de Sanger). En este método, se produce la extensión del fragmento de ADN en su estado de cadena sencilla a partir de un oligonucleótido complementario a una zona del gen. Esta extensión de la cadena se produce gracias a la acción de una enzima (Taq polimerasa) en presencia de los cuatro trideoxinucleótidos (dNTPs). Recordemos; como en el caso de la PCR, salvo que en este caso no será un proceso cíclico. Además, mezclados entre ellos en una baja proporción existirán dideoxinucleotidos (ddNTPs) normalmente marcados radiactivamente, los cuales al añadirse a la cadena naciente terminaran la síntesis de las moléculas en las cuales se inserten, ya que bloquean la incorporación de nuevos nucleótidos. Por el contrario, cuando en una cadena de ADN se insertan únicamente dNTPs continuará alargándose sin problemas. Con este proceso obtendremos toda una serie de fragmentos de ADN de diferentes tamaños, dado que los ddNTPS se habrán incorporado en diferentes lugares. Esto ha de hacerse en cuatro tubos diferentes, uno por cada nucleótido, lo que nos dará información sobre en las posiciones en las cuales estaba presente ese nucleótido determinado en la secuencia original. Para terminar de obtener esta información es necesario separar los fragmentos de ADN de los cuatro grupos en un gel de poliacrilamida en formato capilar (electroforesis capilar) y después visualizarlo. Explicamos este sistema por razones históricas ya que apenas se utiliza actualmente.

Existe una variación de esta técnica, que es la que actualmente esta extendida ya que es más barata y sencilla, y de la cual exponemos un ejemplo de los resultados en la Figura 11. En este segundo método no es necesario utilizar cuatro reacciones por muestra, sino solamente una. Esto se consigue marcando los cuatro dideoxinucleótidos con un marcador fluorescente diferente, los cuales emiten fluorescencia a diferente longitud de onda. Sin embargo, en este caso la amplificación del ADN (PCR) se produce simultáneamente a la incorporación de los dideoxinucleótidos en cada ciclo de la reacción de PCR. De forma parecida al caso anterior es necesario separar los fragmentos mediante una electroforesis capilar. La visualización de los fragmentos se produce de forma automática mediante un láser que activa los fluoróforos y un sistema de recogida de los datos de fluorescencia. Con este sistema se puede analizar en una misma reacción alrededor de hasta unos 1000 pares de bases.

En el caso de que se pretenda secuenciar fragmentos de ARN, y debido a que la estabilidad de esta molécula es mucho menor que la del ADN, es preciso primero fabricar una hebra de ADN complementaria, Esto se consigue mediante una reacción en la que interviene la enzima transcriptasa inversa, la cual forma una secuencia monohebra de ADN complementaria a la de ARN (ADNc). Después de este paso se puede secuenciar tal y como se describe anteriormente.

Existen otros métodos para secuenciar el ADN, por ejemplo el de la pirosecuenciación. Esencialmente, e igual que en los casos anteriores, un oligonucleótido hace de iniciador para la fabricación de una nueva cadena de ADN. Los diferentes nucleótidos se van añadiendo secuencialmente de uno en uno, junto con una mezcla enzimática.

Cada vez que un nucleótido es incorporado a la cadena naciente se originan una serie de reacciones enzimáticas que producen radiación luminosa. Una cámara recoge y cuantifica la cantidad de luz emitida, lo cual nos dirá si la incorporación de un nucleótido en esa posición del ADN ha tenido lugar o no. Después se degradan enzimáticamente los nucleótidos no incorporados o sobrantes y se hace un lavado para eluirlos (el ADN no se lava gracias a estar fijado previamente en una superficie). Ahora ya puede ser añadido el siguiente nucleótido junto con su mezcla enzimática y así sucesivamente. Todo este proceso es realizado de forma automática, llegando a poder ser secuenciadas en la misma reacción hasta unas 100 pares de bases. Sus aplicaciones también incluyen el genotipado de polimorfismos conocidos, cambios en la metilación del ADN y cuantificación alélica la cual permite detectar duplicaciones y deleciones génicas.

Existen otros métodos de análisis genético que son utilizados debido a su menor coste y facilidad de análisis que analizaremos en los siguientes apartados.

2.3.2. Análisis de conformación de cadena sencilla (SSCP)

La técnica de análisis de conformación de cadena sencilla (SSCP, o “single-strand conformation polymorphism”) se basa en los cambios de conformación tridimensional que presentan dos cadenas sencillas de ADN que difieren entre sí en un único nucleótido. Esos cambios de conformación se pueden poner de manifiesto en un gel de acrilamida mediante la aparición de un patrón de bandas diferencial entre las muestras control y las muestras problema.

Primero se amplifican mediante PCR los fragmentos del ADN a estudiar. Se ha de intentar que los fragmentos no sobrepasen los 200 bp, o en caso contrario se pierde sensibilidad para detectar las mutaciones. Los productos amplificados se desnaturalizan mediante calor y en un medio con formamida, para analizarlo seguidamente en un gel de acrilamida junto con muestras de controles sanos y sin mutaciones. Al desnaturalizarse, el ADN monohebra adquiere una o varias conformaciones determinadas, que son la más estables termodinámicamente en las condiciones particulares en que se realiza el experimento. Una mutación puede alterar esta estructura, modificando la facilidad con la que se desplaza a lo largo del gel de electroforesis. La aparición de un patrón de bandas anómalo es indicativo de un posible cambio de nucleótido. Esto ha de ser confirmado posteriormente mediante secuenciación directa. El uso del SSCP proporciona una primera aproximación al análisis mutacional de forma rápida y barata.

Como hemos dicho, tiene algunas limitaciones de uso, ya que las condiciones de electroforesis (temperatura, composición del gel, concentración de tampón etc) deben ser determinadas empíricamente, y la sensibilidad nunca es del 100%. Cuanto mayor sea el fragmento a analizar menor será la sensibilidad (Ravnik-Glavac et al., 1994).

2.3.3. Análisis de heterodúplex

Este método es similar al anterior, salvo que en este caso después de desnaturalizar las hebras de ADN dejaremos que se vaya enfriando poco a poco. De esta forma las monohebras de ADN volverán a renaturalizarse, con la particularidad de que algunas cadenas mutadas se habrán unido a otras no mutadas (heteroduplex), con lo que las dos cadenas serán homologas, excepto en un nucleótido. Esta discordancia de nucleótidos desapareados en este lugar puede crear una ligera alteración en la estructura de la doble cadena de forma que tenga consecuencias en la movilidad electroforética. (Ravnik-Glavac et al., 1994).

Hasta aquí se han descrito métodos para detectar mutaciones no conocidas. Cuando la mutación o polimorfismo ha sido ya caracterizado y se conoce su base molecular es posible diseñar estrategias diagnósticas basadas en la detección de esa secuencia mutada concreta, como las que se explican seguidamente.

El genotipado o especificación de un polimorfismo, se suele realizar utilizando métodos basados en diferentes principios: según el cambio en las propiedades físico-químicas del fragmento de ADN que origina ese cambio genético, mediante hibridación especifica de un fragmento e de ADN (u oligonucleótido) a cada alelo, o bien mediante reconocimiento enzimático de determinadas secuencias.

2.3.4. Determinación de polimorfismos mediante análisis de restricción (PCR-RFLP)

La técnica de la PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism) para la determinación de los genotipos de un polimorfismo se basa en la amplificación de un segmento de ADN y su exposición posterior a una enzima de restricción determinada. Una enzima de restricción (o endonucleasa de restricción) es una enzima que puede reconocer una secuencia determinada de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortarlo en un punto en concreto llamado sitio o diana de restricción, el cual depende de la enzima utilizada. Las enzimas de restricción reconocen secuencias entre 4 y 12 pares de bases. El corte del ADN se realiza rompiendo 2 enlaces fosfato en la doble hebra, dando lugar a dos fragmentos, que pueden ser romos o cohesivos. Estos últimos tienen tendencia a volver a hibridar de modo espontáneo ya que los extremos de un fragmento roto se pueden unir a los otros extremos coincidentes de otro fragmento roto mediante puentes de hidrógeno (como esta unión es muy débil se separarán al realizar una posterior electroforesis). Pero lo que de verdad nos interesa de sus propiedades es que mediante ellas se pueden discriminar mutaciones, ya que cambios de nucleótidos o pequeñas deleciones/inserciones pueden producir la pérdida de una diana o la aparición de una nueva diana donde antes de la mutación ésta no existía (Roberts 1981). Una vez realizada la digestión del ADN es necesario discriminar en que muestras se ha producido la rotura del fragmento en cuestión, y en cuales no. Para ello se realiza una electroforesis y se visualiza mediante posterior tinción (Figura 15).

El fragmento de PCR original se corresponde con un tamaño de algo más de 700 bp. Cuando el alelo A esta presente en ambas cadenas de ADN el enzima corta en otras dos zonas de la secuencia produciendo tres fragmentos diferentes de 309, 242 y 194 bp. Cuando el alelo G esta presente en una de las cadenas aparece una banda extra de 97 bp, debido a que el fragmento de 194 bp se corta por la mitad. Si el alelo G esta presente en las dos cadenas el fragmento de 194 bp no se observa.

2.3.5. Amplificación múltiple (PCR Multiplex)

En algunos casos ocurren deleciones de algunos exones o de fragmentos grandes dentro de un gen. Para su detección se amplifican mediante PCR y de forma simultánea distintos fragmentos de diferentes genes en un solo tubo, utilizando parejas de cebadores u oligonucleótidos previamente optimizados para cada uno de los fragmentos de ADN. El resultado de cada PCR múltiplex se analiza mediante electroforesis obteniéndose un patrón de bandas a partir del cual es posible inferir las regiones delecionadas. Es un método muy rápido y barato, pero limitado, en el sentido de que solo pueden detectarse mutaciones homocigotas. Es apropiado por ejemplo para la búsqueda de deleciones en el cromosoma Y (ya que hay un solo cromosoma). Para la detección de deleciones heterocigotas es necesario la utilización de otros métodos cuantitativos o semicuantitativos.

2.3.6. Amplificación múltiple dependiente de ligación de la sonda

Esta técnica es aplicable tanto al análisis de mutaciones puntuales o SNPs como a delecciones o inserciones grandes de fragmentos de ADN, y permite la realización de varias decenas de análisis genéticos o ensayos de una muestra y a la vez en un mismo tubo (Scarciolla et al., 2007). En esta técnica no es la muestra de ADN genómico la que se amplifica mediante PCR, sino los dos pares de sondas que se hibridan en el ADN. La amplificación específica de los pares de sondas dependerá de la presencia de las secuencias complementarias en el ADN. Para cada uno de los ensayos se diseñan dos oligonucleótidos, de forma que al hibridar sobre la secuencia de ADN diana pueden ser ligados enzimáticamente entre sí (ver Figura 16). Todos los pares de sondas tienen secuencias idénticas en los extremos 5’ y 3’ respectivamente, de esta forma es posible la amplificación simultánea de todos los ensayos con un solo par de oligonucleótidos maestros. Uno de estos oligonucleotidos maestros estará marcado con un fluoróforo.

Los fragmentos resultantes de las diferentes amplificaciones tendrán diferentes tamaños (de 100 a 500 pares de bases aprox.), con lo cual se podrán distinguir separándolos mediante una electroforesis, incluyendo un marcador de peso molecular y utilizando los aparatos automáticos adecuados.

El área de los picos de cada uno de los fragmentos se mide automáticamente a partir de los datos de fluorescencia captados por el aparato de electroforesis. La normalización de los datos se puede realizar calculando el ratio del área de cada fragmento con la suma de la señal de los demás fragmentos. De esta forma estamos haciendo una cuantificación relativa de cada ensayo, y podremos testar la posible presencia de deleciones o duplicaciones génicas (Figura 17).

Además, también es posible identificar SNPs utilizando dos sondas que solo difieren entre sí en el último nucleótido de las mismas, en la posición donde supuestamente esta el polimorfismo. Como para que haya amplificación mediante PCR es necesario que haya una previa ligación de los extremos de las sondas es necesario que ambas sondas hibriden con el ADN muestra particularmente en esa posición. Así, para un heterocigoto, una sonda amplificará uno de los alelos del polimorfismo mientras que la otra sonda solo amplificará el otro alelo.

2.3.7. Determinación de polimorfismos microsatélites

Los polimorfismos microsatélites (o STRs, acrónimo de Short Tandem Repeats) están compuestos por secuencias básicas de 2-4 nucleótidos, cuya repetición en tándem origina frecuentemente secuencias de menos de 150 nucleótidos. Se estima que el genoma humano contiene unos 200.000 microsatélites, que se distribuyen más o menos homogéneamente, lo que junto con la propiedad de que son multialélicos, los hace idóneos para realizar estudios de análisis de ligamiento genético en familias. Las mutaciones inestables son un tipo específico de microsatélites, y consisten en la “expansión” o el aumento de unidades de repetición de nucleótidos (especialmente CA y CAG). Se han identificado este tipo de repeticiones en varios genes humanos asociados a un número importante de patologías neurológicas (Como ejemplo, la enfermedad de Hungtinton). Estas repeticiones de tri o di nucleótidos se encuentran en personas sanas pero en un número menor que en los enfermos y pueden variar de número de una generación a otra, de ahí el nombre de mutaciones dinámicas. El número de repeticiones puede ir creciendo de una generación a otra hasta que sus efectos patogénicos se manifiestan. Además, la edad de inicio de la enfermedad y gravedad de la presentación clínica se suele correlacionar positivamente con el número de repeticiones.

Para determinar el número de repeticiones de los microsatélites se suele amplificar mediante PCR un fragmento de ADN que incluya al polimorfismo en cuestión, y con uno de los oligonucleótidos utilizados marcados con un fluoróforo tal y como en el caso anterior. Seguidamente, el producto de dicha amplificación se analiza mediante electroforesis en un gel de acrilamida, junto con marcadores de peso molecular, para determinar el tamaño de cada fragmento y así obtenemos el genotipo de cada individuo. La concentración del gel acrilamida suele ser relativamente alta para poder discriminar fragmentos de ADN que se diferencias en tan solo 2 o 3 bp (Sambrook et al., 2001).

2.3.8. Genotipado mediante sondas TaqMan

Este es otro método para genotipar que se ha extendido rapidamente por su semcillez y rapidez. Para ello se utilizan las llamadas sondas Taqman (Whitcombe D 1998).

Mediante dos oligonucleótidos se amplifica el segmento de ADN en el cual se halla el polimorfismo diana. Además, están presentes dos sondas TaqMan de unas 10-15 pb que son complementarias a la región concreta del fragmento de ADN adyacente al polimorfismo, y que sólo se diferencian en un nucleótido. Cada una de las dos sondas esta marcada con un fluoróforo diferente en la parte 5’, y cada una de ellas híbrida respectivamente con cada uno de los alelos de un polimorfismo dado. Cada una de las sondas tiene en su parte 3’ un “quencher”, o neutralizador, que hace que el fluoróforo no emita fluorescencia al estar unido al oligonucleótido. El MGB o minor grove binding intensifica la especificidad de la unión de las sondas al ADN.

Cuando la sonda marcada híbrida con el ADN dentro de un ciclo de PCR, la actividad 5’ exonucleasa de la Taq polimerasa utilizada provoca la liberación del fluoróforo y deja de estar en contacto con el neutralizador, emitiendo entonces fluorescencia. Sin embargo, si alguna de las dos sondas hibridadas tiene un nucleótido desapareado (en el lugar del polimorfismo) es mucho menos probable que la polimerasa pueda degradar la sonda, por tanto, no emite fluorescencia y simplemente la sonda es desplazada de la cadena de ADN. Gracias a la especificidad de las sondas y a la actividad 5´exonucleasa de la Taq polimerasa es posible la determinación del genotipo. Mediante la detección de la diferente fluorescencia emitida por cada una de las sondas al final de los 40 ciclos de la PCR podemos conocer cual es el genotipo del polimorfismo. En cada reacción se analiza un único SNP y la reacción se realiza en placas de 96 o de 384 pocillos.

Esta tecnología puede aplicarse utilizando los circuitos integrados fluídicos de DNA. Estos circuitos emplean una red de canales integrados y válvulas que dividen las muestras de ADN y los reactivos de PCR. La muestras se diluyen y se mezclan con los reactivos dentro del chip de forma automática, y pudiéndose conseguir unos pocos miles de genotipos por circuito sin necesidad de cargar a mano todos los pocillos (Ejemplo en. www.fluidigm.com). Sus aplicaciones pueden incluir, además, la cuantificación génica que veremos más adelante.

2.3.9. Chips de ADN para genotipado en gran escala

Hasta aquí hemos explicado los métodos comunes de genotipado que podían ayudar a encontrar mutaciones o polimorfismos relacionados con las enfermedades o con un fenotipo determinado (recordemos que un fn fenotipo es alguna característica observable, ya sea física, emocional etc). Ahora bien, todo esto estaba basado en que teníamos una idea previa de que genes estaban asociados a cada enfermedad. Sin embargo, en muchos estudios no se parte de una idea a priori de que genes puedan estar involucrados en cada fenotipo. En estos casos se puede realizar un análisis de asociación en gran escala, esto es, analizar cientos de miles de SNPs distribuidos uniformemente por todo el genoma en cientos de controles y pacientes para comparar posteriormente las frecuencias genotípicas en los dos grupos. También se puede utilizar esta técnica para realizar estudios de análisis de ligamiento genético en familias.

Para realizar este tipo de estudios se precisa una tecnología que pueda hacer esto de una forma razonablemente rápida y económica. En los últimos años se han desarrollado chips de ADN que pueden genotipar cientos de miles de polimorfismos a la vez.

En líneas generales el proceso consiste en digerir el ADN del sujeto con enzimas de restricción para fragmentarlo a un determinado tamaño, y posteriormente se ligan estos fragmentos a adaptadores de ADN con los que se puede amplificar los fragmentos posteriormente mediante PCR. Estos fragmentos de ADN son marcados, desnaturalizados e hibridados posteriormente en el chip. Estos chips de ADN son fabricados usando una gran variedad de tecnologías, y mediante procesos automáticos que alinean cada una de las sondas para los diferentes polimorfismos en puntos que se separan unos de otros por distancias microscópicas. A grandes rasgos, para fabricar uno de estos chip se sintetizan sondas de ADN de unas 25 bases y se fijan a un soporte sólido. Estas sondas son complementarias a la región génica que se quiere analizar, una de ellas coincide exactamente en el centro con un alelo de un polimorfismo y otra sonda que coincide exactamente con el otro alelo, de forma que cada sonda hibrida con la secuencia de ADN con el alelo correspondiente. En realidad, para comprobar que se cumple esta especificidad se utilizan varias decenas de sondas para cada alelo: utilizando sondas que no coinciden para ninguno de los dos alelos, analizando las dos cadenas de ADN (con sentido y sin sentido), y poniendo en otras posiciones flanqueantes bases no coincidentes como controles negativos. Después del proceso de hibridación, el chip se lava, se tiñe y se escanea para detectar la señal fluorescente en cada posición, y así determinar el genotipo de cada polimorfismo (Kozal et al., 1996).

2.4. Estudios de expresión génica

La presencia de polimorfismos en una secuencia de ADN y/o la exposición a algunos factores ambientales pueden alterar la cantidad expresada de determinados genes. Así, el nivel al cual convergen la genética y los factores ambientales es la expresión génica. De esta forma el perfil de expresión en cerebro podría ser más informativo acerca de la etiología de los comportamientos complejos que el estudio de los factores genéticos y ambientales por separado. Pero además, estas técnicas cuantitativas también pueden emplearse para detectar mutaciones en el ADN por duplicación o depleción de exones.

2.4.1. Análisis de la expresión genética mediante PCR cuantitativa

Métodos descritos anteriormente, como el Northern blot, pirosecuenciación o chips de ADN, pueden ser utilizados para cuantificar la cantidad de ácidos nucleicos presentes en una muestra. Sin embargo, el método más extendido y sensible es la técnica de la PCR cuantitativa a tiempo real, utilizando sondas TaqMan. Para ello se utiliza la misma tecnología explicada en el apartado 2.3.8, solo que en aquel caso se observaba la fluorescencia al final de los ciclos de PCR, y en este método es necesario ir observando el incremento de fluorescencia en cada ciclo.

En vez de sondas TaqMan se puede utilizar el reactivo SYBR green, el cual es un agente intercalante que se une de forma estequiométrica al DNA de doble cadena, siendo entonces fluorescente. Sin embargo este sistema puede ser más problemático, ya que el SYBR green se puede unir a productos de PCR no específicos (incluyendo artefactos presentes en las PCRs conocidos como dímeros de oligonucleotidos) que pueden interferir con la cuantificación especifica del fragmento de ADN que estemos analizando.

Como se explicó en el apartado 2.1.1 el número de moléculas de ADN en una PCR se incrementa teóricamente según la función Ni x 2ⁿ. Así, la concentración relativa de ADN o ADNc durante la fase exponencial se puede representar en escala logaritmica en base 2, expresando la cantidad de fluorescencia respecto al número de ciclos. De esta forma el crecimiento exponencial se presenta en forma de una recta en una fase de la gráfica. Pasado un determinado ciclo, y debido al agotamiento de los reactivos, la fase exponencial se atenúa y entra en una fase de “plateau”, estacionaria o de punto final (Figura 19). La cantidad total de fluorescencia en la fase de plateau depende más de la cantidad de oligonucleótidos original, que de la cantidad inicial de ADNc que queremos cuantificar. Es pues la fase exponencial la que utilizamos para analizar la expresión: es la parte de la gráfica en que realmente se cumple la fórmula Ni x 2ⁿ. El ciclo al cual la fluorescencia de una muestra dada alcanza un determinado valor umbral arbitrario (threshold), pero dentro de la fase exponencial, se le llama Ct (Cycle threshold). Como la cantidad de ADNc se dobla cada ciclo durante la fase exponencial, se pueden calcular los niveles relativos de una muestra con respecto a la otra. Por ejemplo, dos muestras que tengan una diferencia de 4 en el Ct, significa que el que tiene el Ct más bajo tendría 2⁴ = 16 veces más cantidad de ese fragmento de ADNc.

Sin embargo esto es teórico. En la práctica no basta para saber si ese determinado gen se expresa más en una muestra que en la otra, ya que pueden existir diferencias en la concentración de ADNc total que había inicialmente (Ni), ya sea por diferencias en la extracción de ácidos nucleicos o por diferencias intrínsecas de expresión general entre las muestras. Se han de normalizar los resultados utilizando un control interno, es decir ajustando en función de la cantidad de un gen control endógeno en cada muestra (housekeeping gene). Un control endógeno sería un gen necesario para el mantenimiento básico de la célula y que presuntamente no esta sujeto a grandes cambios en la regulación de la expresión, con lo cual mantendría sus niveles de ARN relativamente constantes. No siempre es fácil encontrar un gen control adecuado, por ello es aconsejable utilizar la media geométrica de varios genes control para realizar la normalización.

La diferencia entre el ciclo en que se alcanza el valor umbral del gen estudiado y el valor umbral del gen de control endógeno (o de la media geométrica de varios genes control) es: ΔCt=Ct(Gen estudiado) – Ct (Genes de control endógeno). También podemos normalizarlas respecto a una muestra, escogida arbitrariamente, que nos servirá de referencia (muestra calibradora). Así, se obtendrá la cantidad relativa del gen estudiado en todas las muestras respecto a la muestra patrón, utilizando la fórmula:

ΔΔCt (Muestra testada) = ΔCt(Muestra testada) -ΔCt(Muestra calibradora).

A partir de este valor se obtiene fácilmente la información de cuanto se expresa cada una de las muestras con relación a la muestra calibradora, utilizando la fórmula 2^-(ΔΔCt) (de Ni x 2ⁿ). Pongamos un ejemplo: estamos estudiando la expresión del gen DRD2 en dos muestras diferentes, A y B, y utilizamos como control endógeno el gen GAPDH. Los valores de Ct en la muestra A son Ct=30 para GAPDH y Ct=32 para el gen DRD2 mientras que los valores de Ct en la muestra B son Ct=32 para GAPDH y Ct=35 para DRD2. ¿Cual de las dos muestras presenta más cantidad relativa del gen DRD2?. Aplicando la fórmula anterior compararemos la muestra B con respecto a la A (que hemos tomado como referencia, arbitrariamente): ΔΔCt (Muestra B) = ΔCt_B(35-32) – ΔCt_A(32-30)= ΔCt(3) -ΔCt(2)=1. Aplicando la fórmula obtendremos que en la muestra B hay menos cantidad relativa de transcritos de DRD2. La mitad concretamente: (2^-ΔΔCt= 2^-(1)=1/2). Utilizando estos valores normalizados ya se pueden comparar los controles con los casos utilizando los test estadísticos adecuados.

Es posible que la eficiencia de la reacción de amplificación en un ensayo o gen determinado no sea del 100%, sino menor, por lo que se puede ajustar en la fórmula 2^ΔCt. Por ejemplo, en el caso de que la eficiencia de moléculas amplificadas de un gen en cada ciclo sea del 90%, entonces se calculará según: 0.9 x 2= 1.8^ΔCt.

Para determinar esta eficiencia en cada ensayo existen diferentes métodos. Se pueden hacer diluciones seriadas de una muestra para determinar el Ct en cada una de ellas. A partir de estos valores de cada dilución se hace una recta de regresión, y la eficiencia se calcula mediante la fórmula: Eficiencia=10^{-1/pendiente de la recta} (suponiendo en este caso que las sucesivas diluciones se realicen en factor diez).

También existen otros métodos basados en las cinéticas de reacción; en los cuales se analizan los valores de fluorescencia de cada muestra y en cada ciclo. Para ello se utiliza la regresión lineal en la fase exponencial para calcular directamente la eficiencia en cada muestra, utilizando la fórmula anterior, y sin necesidad de utilizar diluciones seriadas de una muestra artificial.

Afortunadamente, no hay que hacer estos cálculos a mano. Existen algunos programas que hacen todos estos cálculos de la eficiencia de forma sencilla como DARTPCR. Otros programas como Qbase o GeNex calculan las cantidades relativas de cada gen mediante el método ΔΔCt, pudiendo utilizar varios controles endógenos y ajustando la eficiencia para cada gen (programas accesibles en http://genequantification.com/, http://www.tataa.com/).

El método de cuantificación génica relativa es útil en muchos casos en los cuales lo que se pretende es definir si existen alteraciones de expresión entre dos o más grupos de muestras. Sin embargo, para algunas aplicaciones es conveniente llevar a cabo una cuantificación absoluta, es decir, determinar el número de copias del fragmento de ADNc que hay en una muestra determinada. Por ejemplo cuando se quiere determinar con exactitud la carga vírica de un paciente. En este caso tendremos que hacer ineludiblemente una recta patrón (regresión) con diluciones seriadas, a partir de una muestra de concentración conocida, y, a partir de la misma determinar el número de copias de la muestra que testamos (Pfaffl).

2.4.2. Análisis de expresión masiva (microarrays).

Igual que en el caso del análisis de asociación con SNPs, en determinadas ocasiones no se parte de una idea inicial acerca de que genes pueden estar involucrados en una rasgo fenotípico en concreto, y es necesario analizar todos los genes de un tejido u organismo. Para ello es necesario contar con la tecnología adecuada para realizarlo a tiempo y coste razonables. Los chips de ADN se pueden usar para detectar ARN en análisis de expresión en los cuales pueden ser analizados miles de transcritos simultáneamente. Básicamente están basados en la presencia de oligonucleótidos, ADNc o fragmentos de PCR complementarios al RNAm (o ADNc) de la muestra, que hibridan con estos de forma específica para cada gen en lugares determinados del chip.

En este tipo de chip de ARN, se hibrida el RNAm (o ADNc) de dos muestras diferentes (por ejemplo, la misma cantidad de ADNc de un control y un enfermo, o bien “pools” o mezclas de los controles y enfermos) que son marcados, cada uno de ellos con un fluoróforo diferente. La mezcla de ambos es hibridada con los oligonucleótidos del mismo chip de ADN. Así, obtendremos una cuantificación relativa del ARN mensajero original de cada gen basada en la diferencia de señal de los dos fluoróforos entre casos y controles. Finalmente se realizan los cálculos estadísticos pertinentes para detectar diferencias significativas a partir de dichos niveles de fluorescencia y ajustando para múltiples comparaciones (Bustin et al., 2002). Los genes en los que observemos un incremento o decremento significativo de la expresión, comparados con los controles, se deberán recomprobar posteriormente utilizando la PCR cuantitativa.

2.5. Métodos de estudio de modificaciones epigenéticas. Metilación del ADN

En ocasiones algunas características heredadas no se originan en cambios en la secuencia del ADN. Es lo que se conoce como epigenética, y es debido usualmente a la metilación diferencial de algunas citosinas adyacentes a una guanina (CpG). Las zonas promotoras de los genes suelen tener porcentajes altos de secuencias CpG no metilados. Sin embargo, en ocasiones se produce una metilación de estas zonas originando que se silencie la expresión de esos genes, y dando en algunos casos procesos patológicos (Schumacher et al., 2006). Estas alteraciones pueden estudiarse mediante diversos métodos. Explicaremos las técnicas más comunes:

2.5.1. Digestión con enzimas de restricción sensibles a metilación

Algunas enzimas de restricción no solamente cortan el ADN genómico con una determinada secuencia, sino que precisan que existan algunas citosinas metiladas en determinadas posiciones. Posteriormente, el patrón de metilación diferencial del fragmento de ADN de interés se analiza mediante Southern. De esta forma se pueden detectar también patrones de metilación parciales.

2.5.2. Conversión del ADN mediante bisulfito

El tratamiento de ADN con bisulfito de sodio puede convertir las citosinas no metiladas en uracilos. Los uracilos son un tipo de bases nitrogenadas que sustituyen a las timinas del ADN en el ARN, y complementan con las adeninas. Sin embargo, las citosinas metiladas son inmunes a la conversión en uracilos por bisulfitos. Así, esta técnica permite la determinación del patrón de metilación comparando muestras tratadas con no tratadas. Para ello, las muestras se someten al proceso exposición al bisulfito y después se amplifican mediante PCR, como paso previo a la secuenciación. Esto se puede realizar en muestras casos y controles para su comparación entre ellas (Clark et al., 2006).

3.1. Modelos animales utilizados en psicogenética

La Genética necesita de modelos animales para el estudio de los rasgos y procesos que serían imposibles en seres humanos, no sólo por motivos éticos sino también debido a limitaciones temporales.

Estos modelos animales permiten, entre otros, aislar fenotipos, cruzar sujetos consanguíneos, incluir o excluir genes del genoma de los sujetos experimentales, clonar sujetos, sobreexpresar productos biológicos, etc.

En Psicogenética, la principal utilidad de estos modelos animales son: 1) el estudio de rasgos en base a comparar diferentes cepas de una misma especie; 2) el estudio de rasgos a través de mutaciones espontáneas; 3) estudio mediante la potenciación de rasgos fenotípicos sin manipulación genética; y 4) el estudio de rasgos utilizando técnicas de manipulación genética.

El genoma de los animales utilizados en los tres primeros tipos de estudios pueden analizarse (careotipado, PCR, QTL, chips de ADN,...) con el objetivo de estudiar los patrones de expresión génica y encontrar genes potencialmente implicados en la expresión de un rasgo (genes candidatos). Sobre la base de los resultados obtenidos de estos tres tipos de modelos animales se obtiene información valiosa que puede ser útil a la hora de decidir qué genes deberían manipularse genéticamente para estudiar con más profundidad un rasgo determinado (el cuarto tipo de estudio).

Los estudios genéticos utilizan diversos organismos para sus estudios, entre ellos bacterias, levaduras, moscas, gusanos, peces y diversos tipos de mamíferos (roedores, conejos, ovejas,…). En el caso de la Psicogenética las especies más utilizadas son los roedores, tanto ratas como ratones.

3.1.1 Estudios de las diferencias entre cepas de una misma especie

Siempre que se escoja trabajar con roedores, hay que tener en cuenta que existen diferentes cepas (razas) de ratas/ratones, cada una con sus propias características conductuales, lo cual puede influir en los resultados obtenidos.

La comparación conductual de la expresión de un rasgo (p. ej.: agresividad) entre cepas nos permite saber si existe carga genética en dicho rasgo: si al comparar la expresión de un rasgo en dos o más cepas de una misma especie criadas en el mismo ambiente observamos diferencias entre las cepas, podemos afirmar que las diferencias se deben a componentes genéticos. Además, comparando los genotipos de estas cepas podemos encontrar variaciones alélicas que expliquen las diferencias fenotípicas observadas.

3.1.2. Estudios a través de mutaciones genéticas espontáneas

La aparición de animales que presentan mutaciones de forma espontánea en su genoma puede ayudar en el estudio de los rasgos o procesos psicobiológicos.

Conociendo el fenotipo normal de los sujetos de una especie podemos detectar aquellos que son portadores de mutaciones. Puede tratarse de alteraciones genéticas que se manifiesten físicamente (ej.: albinismo), alterando los mecanismos fisiológicos (ej.: alteraciones en la síntesis de proteínas u hormonas) o traducirse en cambios conductuales (ej.: mayor ansiedad).

Una vez detectada fenotípicamente la mutación, mediante técnicas moleculares pueden detectarse las regiones del genoma mutados e identificar con precisión los genes implicados en el rasgo/proceso que fenotípicamente aparece alterado.

Así, los resultados obtenidos del análisis de animales que presentan mutaciones espontáneas pueden orientarnos en el estudio genético de la conducta, presentando genes candidatos a la regulación de un fenotipo.

3.1.3. Modelos clásicos en Psicogenética: abordaje desde el fenotipo

La investigación en Psicogenética empezó utilizando modelos animales que no implicaban ningún tipo de manipulación genética y que se basan en apareamientos programados. De esta manera se conseguían aislar fenotipos concretos y con ello a los genes asociados a esos fenotipos , por eso se dice que este tipo de abordaje es desde el fenotipo al gen.

Existen dos estrategias metodológicas: : la cría selectiva y las cepas consanguíneas.

3.1.3.1. Cría selectiva o Selección artificial

Mediante este procedimiento se persigue obtener líneas de animales extremos para una característica fenotípica. En el caso de la Psicogenética, lo más interesante es criar dos líneas opuestas para un rasgo para poder comparar sus genotipos.

Para ello se parte de una población heterogénea, de manera que estén representados todos los genes, la cual se evalúa para el rasgo que quiere estudiar, por ejemplo: la inteligencia. En este caso, y tratándose de roedores, se podrían utilizar un laberinto de Tolman.

El laberinto de Tolman es un laberinto elevado en el que el roedor es situado en un compartimiento de salida y debe encontrar la meta, en la que obtendrá un reforzador (normalmente comida). El recorrido es el siempre el mismo, de manera que los animales deben aprenderselo y evitar entrar en los brazos del laberinto que no conducen a la meta.

A partir de las puntuaciones obtenidas se escogen aquellos sujetos que tienen puntuaciones más extremas para ese rasgo y se agrupan en función de los resultados en dos grupos opuestos (grupo de animales más listos y grupo de animales más torpes). Una vez hechos los grupos opuestos, se aparean los animales de cada grupo entre ellos. Con las crías nacidas se repite el mismo procedimiento durante generaciones sucesivas (unas 20), evitando apareamientos consanguíneos.

Si el rasgo estudiado depende de factores genéticos, después de varias generaciones conseguimos fenotipos opuestos en las cepas seleccionadas: una línea de animales extremadamente listos contra una línea de animales extremadamente torpes.

Pese a que se evitan los cruces consanguíneos, los sujetos que pertenecen a la misma línea comparten una homozigosis aproximada del 60% de sus alelos.

Así pues, la cría selectiva es una metodología basada en el fenotipo: se selecciona a los animales con puntaciones extremas para un rasgo para crear dos líneas opuestas para ese fenotipo.

3.1.3.2. Cepas consanguíneas

Este tipo de cría selectiva pretende obtener sujetos homocigóticos para todos los loci en base a cruzar hermanos entre sí y así, después de sucesivas generaciones, obtener sujetos idénticos tanto genotípicamente como fenotípicamente.

A las cepas consanguíneas también son denominadas cepas inbred (endogámico en inglés), que es un término que se contrapone al de outbred, que indica que los apareamientos se realizan evitando cualquier parentesco genético.

Se parte de una población general y se inician los apareamientos entre hermanos, las crías de estos hermanos se aparean entre ellos, y así sucesivamente, durante aproximadamente unas 20 generaciones.

Las diferencias individuales dentro de una cepa se deben a factores ambientales. En cambio, cuando se comparan dos cepas inbred que viven bajo el mismo ambiente, las diferencias entre éstas ponen de manifiesto influencias genéticas para la conducta estudiada.

3.1.3.3. Recombinación de cepas consanguíneas

Se basa en cruzar animales de dos cepas consanguíneas, preferiblemente con fenotipos opuestos,seguido de unos veinte cruces consanguíneos entre hermanos y hermanas, de forma que los cromosomas se recombinan varias veces, dando lugar a un único patrón de recombinantes de los cromosomas de cada cepa. A partir de la utilización de esta técnica se pueden hacer mapas genéticos de la localización de distintos genes utilizando enzimas de restricción y polimorfismos genéticos.

3.1.4. Modelos con animales manipulados genéticamente: abordaje desde el genotipo

Las recientes técnicas de manipulación genética han permitido alterar a voluntad el genotipo de los individuos, tanto excluyendo genes, como haciendo que los genes se expresen en momentos determinados, como introduciendo genes de una especie en otras. El objetivo de estas manipulaciones es observar cómo afecta la manipulación de un gen concreto al fenotipo de los sujetos, por eso se trata de un abordaje desde el genotipo. Los animales que suelen utilizarse para este tipo de manipulaciones son los ratones (modelos murinos), ya que el genoma de esta especie está ampliamente caracterizado.

Las principales técnicas de manipulación genética utilizadas por la Psicogenética son la eliminación de genes (knock-out) y la introducción de genes de una especie en otra (transgénicos).

3.1.4.1. Animales knock-out

Esta técnica permite inactivar/silenciar la expresión de un gen (gen diana), así se puede observar el efecto de la falta de ese gen en el fenotipo. Experimentalmente se fundamenta en el principio de la recombinación homóloga y en la utilización de células madre embrionarias.

Una vez escogido el gen que se quiere modificar (gen diana), mediante técnicas de ingeniería genética se genera una modificación en alguna de las secuencias del gen objeto de estudio que permita inactivarlo, normalmente se escoge la secuencia correspondiente al exón de inicio del gen. Además de la secuencia que inactivará el gen diana, se añaden dos genes más, uno de selección positiva y otro de selección negativa. El gen de selección positiva es un gen resistente a los antibióticos (normalmente el gen Neo, resistente a la neomicina), que se inserta dentro de la zona de recombinación; y el de selección negativa, que suele ser el gen timidina quinasa del virus del herpres (HSV-tk), se sitúa en el extremo de la secuencia, fuera de la zona de recombinación homóloga. Toda esta secuencia manipulada se introduce en un vector, normalmente un retrovirus.

Una vez que el vector está preparado, se realiza una extracción de células madre embrionarias (embrionic stem cells), obtenidas de blastocitos de roedores gestantes y mantenidas en cultivo. A estas células se las somete a un choque eléctrico que abrirá un poro en la membrana celular (electroporación) por el que penetrará el vector.

La secuencia mutada que ha sido introducida por el vector se incorpora a la cadena de ADN de las células embrionarias mediante el proceso de recombinación homóloga, produciéndose el reemplazo del gen modificado.

Hay que tener en cuenta que no todas las recombinaciones serán exitosas, por lo que debe comprobarse cuáles de las células son las que han incorporado la secuencia del vector. Para ello se aplica el antibiótico para el que se ha introducido la resistencia (neomicina) al cultivo de células embrionarias, de manera que morirán aquellas que no posean el gen resistente (selección positiva), y un agente antivírico (ganciclovir) que eliminará las células hayan incorporado la secuencia vírica (selección negativa). Las células en cultivo que sobrevivirán a los procesos de selección serán aquellas que hayan incorporado en gen mutado y se llaman recombinantes. En este paso pueden utilizarse técnicas de biología molecular para comprobar que realmente la secuencia que hemos introducido se ha incorporado en las cèlulas que han sobrevivido (Southern, PCR).

En una segunda fase, se microinyectan las células embrionarias recombinantes en embriones de ratón de un color diferente al de la hembra de la que se extrajeron las células embrionarias (p.e.: si la hembra donante de las células embrionarias es marrón, los embriones pueden proceder de una hembra negra). Estos embriones se implantan en hembras pseudopreñadas de un color diferente a las anteriores (pe: blanca).

Las crías que nazcan estarán formadas por los dos tipos de células (células embrionarias manipuladas y células embrionarias sin manipular) y se llaman quimeras, es fácil identificarlas por su pelaje (en este caso, mitad marrón, mitad negro). De todas formas debe confirmarse el genotipo mediante técnicas de biología molecular, analizando una muestra de células obtenidas de la cola.

El último paso consiste en establecer una línea de knock-out. Para ello, se iniciará un primer apareamiento entre las quimeras y ratones de la cepa de la cual se han obtenido los blastocitos (en nuestro ejemplo, de color negro). Las crías nacidas de este cruce que sean de color marrón serán las que porten el gen modificado (hay que tener en cuenta que en esta primera generación sólo un 50% de las crías de las quimeras serán recombinantes). Estos animales se aparearán entre sí para llegar a generar una cepa de animales en que toda la descendencia posea el gen diana inactivado.

Así pues, en los animales knock-out se introduce una manipulación genética que inactiva la expresión de un gen, así nos permite estudiar el efecto de su eliminación sobre el fenotipo.

3.1.4.2. Animales transgénicos

La creación de organismos transgénicos consiste en introducir un gen de una especie (p.e.: humana) en el genoma de otra especie (p.e.: ratones). De esta forma se puede aislar y caracterizar la expresión de ese gen, lo que facilita el estudio de su participación en la expresión de rasgos y enfermedades, así como sus mecanismos de actuación. Además, pueden utilizarse estos animales para probar nuevos agentes terapéuticos.

En este caso la inserción del gen no está dirigida como en los knock-out si no que se produce de forma aleatoria.

En una primera fase se aísla la secuencia de ADN que contiene el gen objeto de estudio, llamado transgen. Mediante técnicas de manipulación genética se añade a esta secuencia un promotor propio de la especie a la que vamos a inyectar el transgen para garantizar la expresión génica. Aunque esta secuencia de ADN modificada puede introducirse en el genoma del receptor a través de la infección de células madre embrionarias (igual que en los knock-out), la técnica más utilizada y eficaz es inyectar la secuencia directamente en óvulos fecundados, concretamente en el pronúcleo masculino.

Los embriones/óvulos inyectados serán implantados en hembras pseudopreñadas, en las que se desarrollarán. Una vez nacidas las crías hay que comprobar cuáles han incluido la secuencia de ADN en el genoma. Para ello se genotiparán las crías analizando una muestra de células extraídas de la cola.

Con aquellos individuos que hayan incorporado el transgen se iniciará una serie de apareamientos programados siguiendo el procedimiento de cría inbred con el objetivo de crear una línea de animales que presente el transgen (se requieren al menos 10 generaciones).

Así los animales transgénicos se introduce un gen de otra especie para poder estudiar de forma controlada su expresión y poder caracterizar sus mecanismos y probar nuevos agentes terapéuticos en ellos.

3.1.4.3. Otros procedimientos de manipulación genética en animales

A continuación se comentarán otras técnicas de manipulación genética que permiten solventar algunos de los problemas que aparecen en los knock-out.

3.1.4.3.1. Animales knock-out inducidos

Para solventar el problema de silenciar genes vitales para el desarrollo se ha desarrollado la técnica de los knock-out inducidos. Esta técnica permite silenciar el gen después de la etapa el desarrollo, cuando la inactivación del gen no es letal.

Se basa en la misma metodología que los knock-out pero añadiendo un gen promotor en la secuencia manipulada que se activa por una sustancia (factor de trascripción) que no se encuentra en el organismo. Cuando el periodo crítico del desarrollo ha pasado y el investigador lo considere oportuno administrará el factor de transcripción a los animales (inyectándolo o añadiéndolo al agua/comida) de manera que se unirá al promotor iniciando la inactivación del gen diana.

Así, los knock-outs inducidos permiten al experimentador decidir el momento en que se inactivará el gen diana.

3.1.4.3.2. Animales knock-out dirigidos

Para evitar que la desactivación del gen diana afecte a todos los tipos celulares del organismo se han desarrollado los knock-out dirigidos, en lo que escogemos de forma específica en qué tipo de células del organismo no se va a expresar el gen (por ejemplo, que no se exprese en neuronas dopaminérgicas).

Como antes, se basa en la metodología de los knock-out, pero en este caso el vector que se introduzca portará la secuencia con el gen diana manipulado asociada a un gen característico del tipo celular que se inactivará (en el ejemplo de las neuronas dopaminérgicas, a algún gen asociado a los enzimas de síntesis del neurotransmisor).

Así se puede estudiar el efecto de silenciar un gen sólo en un tipo celular concreto y no de forma generalizada, como en los knock-out tradicionales.

3.1.4.3.3. Animales knock-in

La técnica knock-in consiste en insertar un gen objeto de estudio en un locus concreto del genoma de forma que sustituya a uno de los genes del organismo receptor. Así no se trata de inactivar un gen como en los knock-out, si no de sustituir un gen por otro.

Se basa en la misma metodología que los knock-out convencionales pero cambia la composición de la secuencia introducida en el vector, de forma que además del gen que queremos silenciar y los genes de selección positiva/negativa, añadimos una secuencia con el gen que sustituirá al gen silenciado.

Así, los knock-in permiten introducir un gen en un organismo que sustituirá a un gen del organismo receptor.

3.1.4.3.4. Animales knock-down

La técnica del knock-down consiste en reducir la expresión de un gen, sin llegar a inactivarlo completamente. Para ello se introduce un agente que impedirá los procesos de transcripción o traducción génica (actuando sobre el ADN o ARNm según corresponda). La reducción de la expresión génica puede ser permanente, pero también puede ser reversible, lo cual no implicaría modificaciones en el ADN cromosómico (knock-down transitorios).

3.2. Utilidades de los modelos animales en psicogenética

Como ya se comentó al inicio de este apartado, el uso de animales aporta grandes ventajas a los estudios psicogenéticos, siendo los roedores las especies más utilizadas con estos fines. De entre todas las razones que se comentaban hay que destacar dos factores que hacen que sea una ventaja trabajar con ellos: el amplio conocimiento tanto del genotipo como del fenotipo de estas especies (especialmente de los ratones), y la gran variedad de publicaciones científicas que respaldan su utilización para el estudio de procesos psicológicos (memoria, aprendizaje, ...).

En este apartado se mostrarán algunos ejemplos prácticos del uso de modelos animales en Psicogenética, así como consideraciones que deben tenerse en cuenta a la hora de utilizar estos animales.

3.2.1. Aportaciones a los estudios de Psicogenética de las cepas outbred

Recordemos que el sistema de cría outbred se basa en cruzar individuos sin ningún tipo de parentesco, ni bajo ningún criterio basado en rasgos fenotípicos. De esta forma se obtiene una población heterogénea en la que todos los alelos estarían representados.

Las cepas outbred nos permiten dos abordajes: por una parte estudiar la distribución de un rasgo en una población heterogénea, y por la otra comparar un rasgo en razas criadas en un mismo ambiente, si aparecieran variaciones podría descartarse las variables ambientales en la expresión de ese rasgo.

Las principales cepas de ratas outbred son las Wistar, Long-Evans, Sprague-Dawley, OFA, Zurich y Lister-Hooded. Las principales cepas de ratones outbred son los NMRI, Swiss-Webster, CD-1 y OF.

3.2.1.1. Estudio de la distribución de un rasgo en poblaciones heterogéneas

En 2003, de Boer y colaboradores, estudiaron distribución de la respuesta agresiva en una población outbred de la cepa de ratas Groening (criadas en su propio laboratorio). El paradigma que utilizaron fue el del intruso en la colonia y recogieron diferentes parámetros relacionados con la expresión de la agresividad (conductas ofensivas, exploración social y no social, inactividad, conductas de limpieza y latencia en el ataque). En base a estos parámetros clasificaran los niveles de agresividad como bajos, medios o altos.

Los investigadores observaron que las ratas Groening presentaban una distribución heterogénea de las conductas agresivas, con sujetos en cada uno de los niveles definidos de agresividad.

Así mismo, estos autores estudiaron también la respuesta agresiva de las ratas de la cepa Wistar bajo el mismo paradigma y observaron que en esta cepa la distribución no era heterogénea ya que mostraban índices de agresividad muy bajos (en 70% de los animales estaba en el nivel bajo de agresividad).

Los resultados de este estudio ponen de manifiesto que existen diferencias fenotípicas entre las cepas de una misma especie, que deben tenerse en cuenta a la hora de seleccionar la raza de animales que mejor pueda representar toda la variabilidad el rasgo que queremos estudiar. Estas diferencias fenotípicas en una misma especie, provienen de variaciones alélicas que se acumulan en cada cepa y es típico de comunidades reproductivamente aisladas. En la especie humana también se dan estas variaciones entre razas, por ejemplo los orientales tienen una alteración en una de las isoformas del enzima aldehído deshidrogenasa (concretamente la ALDH2*2), encargado de metabolizar el alcohol, que se traduce en una ineficacia en la eliminación de esta sustancia e intensas intoxicaciones etílicas.

3.2.1.2. Estudio del efecto del ambiente compartido y del genoma entre cepas de una misma especie

Retomando el hilo que lo dicho en el apartado anterior y partiendo del supuesto de que cada cepa de una misma especie posee características genéticas propias, si en un estudio en el que se compara la expresión de un rasgo entre diferentes cepas que comparten ambiente, se observan diferencias, éstas se deberán a la variabilidad genética entre cepas.

Varty y Higgins, en 1994, evaluaron la ejecución de la inhibición pre-pulso en tres cepas de ratas diferentes: Sprague-Dawley, Lister-Hooded y Wistar. Este paradigma es útil para medir la respuesta de sobresalto, que en pacientes esquizofrénicos se encuentra alterada, y que si se modela en animales permite probar la eficacia de fármacos antipsicóticos.

Sus resultados demostraron que ratas de diferentes cepas criadas en un mismo ambiente presentaban diferencias en la realización de esta prueba: las ratas Wistar eran menos sensibles a las señales pre-pulso. Lo cual hace pensar que este rasgo asociado a la esquizofrenia depende de factores genéticos.

Así, si las cepas de una misma especie, criadas en el mismo ambiente, presentan diferencias en la expresión de un rasgo, esto indica que este rasgo depende fundamentalmente de factores genéticos.

3.2.2. Aportaciones a la Psicogenética de las mutaciones genéticas espontáneas

Como ya se dijo anteriormente, la aparición de mutaciones genéticas espontáneas nos permite detectar los genes implicados en el rasgo afectado. Es necesario conocer el fenotipo normal de una especie para poder identificar las mutaciones cuando aparezcan (el fenotipo tanto físico, como conductual y fisiológico).

Los ejemplos más paradigmáticos son los estudios a través de mutaciones espontáneas de dos enfermedades, la obesidad y la narcolepsia.

Estudio de la obesidad a través de mutaciones genéticas

En los años 50 el estudio de la obesidad se vio impulsado con la aparición de una camada de ratones que de forma natural eran obesos.

Se estudió a estos animales y se observó que presentaban la ausencia de una hormona llamada leptina. Genéticamente se comprobó que estos ratones presentaban una mutación en una porción del cromosoma 4, en un loci que denominaron ob. Los ratones obesos presentaban en homocigosis la mutación del gen ob (ob/ob), así que se relacionó a esta porción del ADN con la síntesis de leptina. En 1994, Zhang et al. demostraron mediante técnicas de clonación que efectivamente el gen ob participa en la síntesis de leptina, y también que la porción del cromosoma humano 7q31.3 es el equivalente al gen ob en ratones.

Estudio de la narcolepsia a través de mutaciones genéticas

En los años 60 aparecieron algunas camadas de perros de las razas Doberman y Labrador que mostraban algunos síntomas de los que presentan los pacientes narcolépticos, más concretamente sufrían ataques de cataplejía (pérdida súbita del tono muscular sin pérdida de conciencia).

Los estudios genéticos mostraron que estos perros tenían una mutación en el cromosoma 12, concretamente en la porción que codifica los receptores tipo 2 para las hipocretinas, unas hormonas exclusivas del hipotálamo que regulan los niveles de vigilia. Recientemente se ha demostrado que esa porción del genoma de los perros corresponde a la porción 6p12-q13 del genoma humano (Li et al., 2001).

3.2.3. Aportaciones a la Psicogenética de los modelos clásicos

Recordemos que las técnicas de estudio basadas en el fenotipo constituyen los modelos clásicos en psicogenética y son aquellos métodos que sin manipulación genética permiten aislar fenotipos. Los modelos clásicos permiten el estudio comparativo de animales claramente opuestos para un rasgo, una valiosa herramienta para detectar las variaciones alélicas que participan en los rasgos.

3.2.3.1. Estudio comparativo de rasgos a partir de fenotipos opuestos mediante líneas seleccionadas

La cría selectiva ha permitido el aislamiento de fenotipos concretos. Como ya se ha comentado, consiste en seleccionar los sujetos que obtienen puntuaciones extremas para un rasgo y aparearlos entre sí durante sucesivas generaciones. Normalmente se crían dos líneas paralelas, cada una para un extremo del rasgo, de manera que podamos compararlas. Si el rasgo depende fundamentalmente de los genes, conseguiremos líneas de animales con fenotipos opuestos para ese rasgo. En principio podríamos intentar establecer líneas para cualquier rasgo que evaluáramos (lo que no es lo mismo que conseguir líneas diferenciadas).

Muchas veces sucede que existen varias líneas de animales seleccionados para un mismo rasgo, pero hay que tener en cuenta el hecho de que la selección se realice en base a un mismo rasgo no implica que estas líneas tengan que ser iguales genéticamente. Estas líneas pueden diferir debido a:

• la cepa de roedor de la cual se originen (Wistar, OFA,…)

• el tipo de prueba que se utilice para realizar la selección, ya que cada prueba tiene sus propias características y mide el rasgo de forma diferencial

• aún utilizando la misma prueba pueden utilizarse diferentes parámetros para valorarla

Así, mediante la comparación de los genotipos de opuestos obtenidos mediante cría selectiva es posible identificar genes candidatos a participar en la regulación de un rasgo. Algunos de los rasgos que más se han seleccionado han sido la ansiedad y la adicción, que servirán para ejemplificar los puntos que acabamos de comentar.

Estudio de la ansiedad a través de la cría selectiva

Principalmente las cepas de ratas ansiosas se han seleccionado en base a su ejecución en el paradigma de evitación activa que consiste en situar al animal una jaula con el suelo electrificado separada en dos compartimentos, se coloca al sujeto experimental en uno de los compartimentos y se presenta un EC (una luz o un sonido) seguido de un choque eléctrico (EI), dejando la posibilidad de pasar al otro compartimento de la jaula para escapar del EI (evitación). En función de los resultados se subdividen los sujetos en altos o bajos evitadotes: High vs Low Avoidance: (HA vs LA), por ejemplo: las líneas de ratas Romanas (RHA vs RLA), las ratas Siracusa (SHA vs ALA) y las ratas Australianas (AHA vs ALA). Pese a se seleccionadas bajo el mismo paradigma cada una posee sus propias características, que se recogen en la tabla siguiente (adaptada de Escorihuela et al, 1994):

Un ejemplo de la utilización de estas líneas seleccionadas fue el estudio del 2005, Zhang et al que utilizaron las dos líneas opuestas de las ratas Siracusa para identificar genes candidatos a participar en la expresión de la ansiedad. Genotiparon animales SHA y SLA mediante microarrays de ARN y RT-PCR cuantitativa. Los resultados de esta investigación presentaron ocho genes candidatos, entre ellos el gen SLC6a4 situado en el cromosoma 10 y que se sobre-expresaba en la línea SLA. Este gen está relacionado con la síntesis del transportador de la serotonina.

Los mismos autores del estudio señalan que sus resultados no coinciden con los obtenidos por otros autores con las líneas Romanas, donde los genes candidatos se encontraban en cromosomas diferentes (Fernandez-Teruel et al, 2002).

Otra línea de ratas muy utilizadas en el estudio de la ansiedad son las Mausdley clasificadas en Reactive vs Non Reactive, seleccionadas por su actividad en el campo abierto.

Estudio de la adicción a través de la cría selectiva

Para los estudios de adicción los criterios de selección pueden realizarse en función de una sustancia determinada (cocaína, alcohol, benzodiacepinas,…), la respuesta a esa droga (sensibilidad, inducción de analgesia, cambios en la actividad psicomotriz,…) o los efectos a largo plazo (desarrollo de tolerancia, dependencia o síndrome de abstinencia).

En la siguiente tabla hay una relación de algunas de las líneas de roedores más utilizadas en el estudio de las conductas adictivas y alguno de los criterios de selección utilizados (adaptada de Crabbe et al, 1999)

El estudio comparativo del genoma de dos líneas opuestas seleccionadas puede ayudar en la búsqueda de cuáles son los alelos implicados en la conducta adictiva. Por ejemplo, diversos estudios con las líneas de ratones LS y SS, seleccionadas por su sensibilidad al alcohol, reveló que el polimorfismo A529T del cromosoma 2 (equivalente al cromosoma 20 humano),implicado en la síntesis de la subunidad α4 de los receptores nicotínicos, está estrechamente vinculado con el aumento del consumo de nicotina y de alcohol, así como con el desarrollo del síndrome de abstinencia (Butt et al, 2003).

3.2.3.2. Estudio comparativo de rasgos a partir de procedimientos de cría inbred

Las cepas consanguíneas se obtienen mediante apareamientos entre hermanos durante varias generaciones con el objetivo de crear sujetos homocigóticos para casi todos los loci, obteniéndose sujetos clónicos. Esto reduce la variabilidad entre-sujetos de una misma cepa.

Esto permite identificar genes candidatos a participar en la regulación de un rasgo con la ventaja que se parte de una población genéticamente idéntica.

Las cepas consanguíneas de ratas más utilizadas son la Wistar-Kyoto, Wistar-Furth, CDF/Fischer, Lewis o BN/Mcwi. Las cepas consanguíneas de ratones más utilizadas son las BALB/c, BDA1, BDA2, C57BL/6, C57BL/10 o C3H.

Una vez establecidas las cepas consanguíneas se les realizan diferentes baterías de tests conductuales para ver qué características fenotípicas han quedado fijadas en cada cepa (secreciones hormonales, actividad cardiaca, pruebas de memoria, ansiedad, adicción, actividad, etc.). En función de qué rasgos se vean potenciados o empeorados en cada cepa consanguínea, se utilizarán para evaluar un rasgo o patología determinada.

Las cepas consanguíneas DBA/2 y C57BL/6 como herramientas de estudio psicogenético

Las cepas inbred que se utilizan de forma más habitual son los ratones BDA/2 y los C57BL/6, ya que presentan fenotipos completamente opuestos para algunos rasgos. Así, a nivel práctico estas dos cepas actuarían como roedores pertenecientes a dos líneas de cría selectiva pero con la ventaja de tener animales exactamente idénticos dentro de cada cepa, lo que permite reducir la variabilidad individual a la hora de analizar los resultados.

Estas dos cepas difieren en capacidad de aprendizaje, ansiedad, exploración y susceptibilidad al consumo de sustancias adictivas: siendo los C57BL/6 más hábiles en ciertos tipos de aprendizajes, más ansiosos, menos exploradores y más susceptibles a la adicción.

En relación con la conducta adictiva, se han realizado múltiples trabajos comparando los genomas de ambas cepas y los de sus recombinantes para buscar genes candidatos a participar en los procesos adictivos, como los realizados por Rodríguez y Plomin. Estos investigadores, junto a otros colegas (1995 y 1998), estudiaron mediante QTL en recombinantes C57BL/6 x DBA/2 los genes implicados en la adicción al alcohol. Los dos análisis confirmaron el peso de los genes situados en los cromosomas 1, 2, 4 y 10 en el consumo de alcohol, relacionados entre otros con la codificación de receptores colinérgicos, serotoninérgicos, enzimas participantes en el metabolismo del alcohol y diversos canales iónicos.

3.2.4. Aportaciones a la Psicogenética de los animales manipulados genéticamente

Las técnicas de manipulación genética nos permiten comprobar la implicación en un rasgo de los genes que otras técnicas han presentado como candidatos (estudios con mutaciones, con cepas seleccionadas, QTL, etc). Los animales manipulados genéticamente permiten estudiar los mecanismos de expresión del gen, su participación en el rasgo o buscar estrategias terapéuticas en caso de enfermedades.

Los resultados obtenidos con estos animales siempre tienen que compararse con un grupo de animales no manipulados genéticamente que sirvan de referencia (los llamados wild type en inglés). Estos grupos de control deben tener las mismas características que los manipulados en cuanto a edad, dieta, mantenimiento, etc.

3.2.4.1. Estudios basados en la falta de expresión de un gen

El hecho de conocer el genoma de una especie y poder eliminar genes permite investigar cuáles son las funciones específicas de los genes eliminados y en qué grado participan en la expresión de uno o varios rasgos. Así, knock-out permiten estudiar la participación de un gen en un rasgo en base a su ausencia.

Eso sí, no hay que olvidar que pese a que silenciamos la expresión de un gen, cabe la posibilidad de que se produzca algún efecto compensatorio por parte del resto de los genes que enmascare el efecto de la eliminación del gen.

Estudio de la ansiedad a través de los knock-out

En base a los datos obtenidos en estudios de cría selectiva con las cepas SHA y SLA (ver apartado 3.2.3.1.), se propuso el gen del transportador de la serotonina como posible candidato a la regulación de la ansiedad. Por ello, algunos investigadores han decidido silenciar este gen para ver cómo se expresa la ansiedad en los animales que carecen de dicho transportador.

Después de generar el knock-out para el transportador de la serotonina y que se haya establecido una línea de animales se debe valorar el efecto de la inactivación genética con pruebas conductuales que evalúan específicamente la ansiedad (pe: campo abierto, evitación activa, laberinto elevado, etc.) y comparar su ejecución con los animales wild type.

En la siguiente tabla se recogen algunos resultados obtenidos silenciando el gen del transportador de la 5-HT, así como con otras líneas de knock-outs (KO) en relación con los wild type (WT), en diferentes pruebas de ansiedad (extraído de Finn et al, 2003):

Estos resultados confirman la implicación del transportador de la serotina en la expresión de la ansiedad, así como la existencia de diversos sistemas implicados en la expresión de este rasgo y que la eliminación de una de las subunidades de un receptor puede alterar significativamente este fenotipo. En algunos de estos cambios sólo se observan en uno de los sexos.

Curiosamente también se recoge el hecho que si el subtipo de receptor 5-HT_1A se modifica de forma condicional, la expresión de la ansiedad es igual a la de los wild type. Este estudio fue realizado por Gross et al, en 2002, que consiguieron crear una línea de ratones en los de forma específica podían manipular el momento de expresión del receptor 5-HT_1A en zonas concretas del cerebro como el hipocampo y el cortex. De forma que se “rescataba” a los ratones knock-out permitiendo que el gen volviera a expresarse específicamente en córtex e hipocampo, lo que fenotípicamente se traducía en que su ejecución en pruebas de ansiedad era igual a los wild type.

Estudio de la adicción a través de los knock-out

En el caso de la adicción, como la dopamina es el principal implicado en el circuito del refuerzo, todos aquellos genes implicados en la síntesis de receptores o enzimas relacionados con este neurotransmisor han sido objeto de estudio. Haile et al, en 2007 realizaron una revisión de los efectos de silenciar algunos genes relacionados con el sistema dopaminérgico sobre el consumo de cocaína. Han observado que cada receptor de la dopamina está relacionado con aspectos diferentes del consumo a esta sustancia, por ejemplo el receptor D₁ está implicado en la activación motora, el D₂ en el reconocimiento de estímulos discriminativos del consumo o el D₃ en el establecimiento de asociaciones condicionadas al consumo.

Actualmente se está estudiando el papel del receptor de los cannabinoides CB₁ en los procesos adictivos. Se ha observado que los knock-outs para el receptor CB₁ no desarrollan condicionamiento de lugar ni para la nicotina ni para el alcohol, y que estos animales consumen menos alcohol y menos cocaína (Castañé et al., 2002; Thanos et al., 2002; Soria et al. 2005).

3.2.4.2. Estudios de mediante animales trangénicos

Recordemos que los animales transgénicos expresan un gen de otra especie (en este caso de la humana) con el objetivo de estudiar y caracterizar la expresión de ese gen aisladamente. En el caso de que el gen esté asociado a alguna patología concreta, además de caracterizarlo permite probar nuevas estrategias terapéuticas. Actualmente se estudian mediante esta técnica enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer o el Parkinson.

Estudio de tratamientos para enfermedades neurodegenerativas mediante transgénicos: Alzheimer

El Alzheimer es el tipo de demencia más común en la población occidental, cuya característica histopatológica es la aparición de ovillos neurofibrilares y placas betaamieloides, así como un aumento en la fosforilación de la proteína Tau. Se sabe que es una enfermedad poligénica (menos la variante precoz, que es monogénica), así que hay diversas dianas genéticas.

En 2005 (Oddo et al.) se evaluó el potencial terapéutico de la nicotina contra el Alzheimer, ya que algunos estudios parecían indicar que el consumo de esta sustancia podía disminuir la agregación de placas de beta−amieloide. Para ello se utilizó los ratones 3xTg-AD, que portan el gen promotor de la proteína amieloide (APP_Swe) y el gen humano de proteína Tau (tau_P301L), de forma que estos ratones desarrollarán placas amieloides y presentarán niveles altos de proteína Tau, igual que los humanos que presentan la enfermedad de Alzheimer. Durante 5 meses, a estos animales se les administró nicotina en el agua que bebían. Después de este periodo observó que el tratamiento no había hecho disminuir el número de placas amieloides, y que de hecho había aumentado los niveles de Tau. De esta forma demostraron que la nicotina no era tan buen agente terapéutico contra el Alzheimer.

Estudio de tratamientos para enfermedades neurodegenerativas mediante transgénicos: Parkinson

Actualmente se está empezando a estudiar la enfermedad de Parkinson mediante el uso de animales transgénicos que sobre-expresan la proteína alfa-sinucleína, una proteína que se acumula en la sustancia negra en esta enfermedad (Yacoubian et al., 2007).